一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法。所述引物用于扩增BRAF基因目标区域，所述引物中至少有一个引物上含有可断裂位点和/或可切除序列，所述可断裂位点包括核糖核苷酸，所述可切除序列包括RNA序列和/或限制性内切酶识别序列。本发明专利技术巧妙设计用于检测BRAF基因的引物，在对BRAF基因中的目标区域进行扩增后，将可断裂位点或可切除序列带入扩增产物中，使得扩增产物在后续的切割和连接能够在同一个反应体系中进行，简化了BRAF基因突变检测的步骤，提高了检测效率。提高了检测效率。提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于基因工程及分子生物学
，涉及一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]BRAF位于染色体7q34的BRAF基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RAF家族成员之一。BRAF蛋白与BRAF蛋白同为RAS
‑
RAF
‑
MEK
‑
ERK信号通路中上游调节因子，在MAPK/ERK信号通路中起着举足轻重的作用。BRAF突变可见于多种恶性肿瘤，例如结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等。
[0003]BRAF基因突变可通过两种途径致病，一是因遗传而导致先天性缺陷的途径，二是后天获得致癌基因而导致肿瘤的途径。BRAF蛋白位于MEK/ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，影响细胞分化、分裂、增殖、生长。BRAF的持续激活可引起MEK/ERK信号转导紊乱，导致细胞过度增殖、恶变。
[0004]BRAF突变有40余种，90％的BRAF突变发生在编码区的1799位核苷酸T突变为A，导致其编码蛋白第600位谷氨酸被缬氨酸代替(V600E)，使得BRAF V600突变型较野生型激酶活性增强500倍，成为癌症驱动基因，具有很强的致癌作用。研究发现BRAF V600突变阳性细胞对MEK抑制剂及BRAF抑制剂非常敏感，临床试验证实BRAF V600突变阳性的非小细胞肺癌患者接受MAPK通路抑制剂维莫非尼，OS和PFS均有所延长。因此BRAF基因突变的检测对指导肿瘤患者精准用药、避免不必要的开支负担，有重大意义。
[0005]在现阶段，为了实现对BRAF基因突变的检测，可采用多种方案。其中，利用高通量测序技术实现对BRAF基因突变的检测一般包括以下步骤：(1)通过PCR扩增获得含待测定目标区域的核酸分子；(2)在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测序文库；(3)单分子扩增所得测序文库；4)利用高通量测序技术对单分子扩增产物进行测序，得到目标区域的序列信息。
[0006]如CN114381510A公开一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法；包括提取cfDNA样本，基于提取的cfDNA样本，配置用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增，对扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序，采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息。但是，为了实现这两种接头分子与含待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要依次进行切割、连接，或连接、切割、连接的反应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物(两种接头自身或相互之间连接的产物、接头连接位置错误的产物)的生成，还需要进行1至2次的分离纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。
[0007]综上所述，在上述方法基础上进行的BRAF基因突变检测方法步骤繁杂，检测效率低。同样，用于上述方法的BRAF基因突变检测试剂盒同样在测序过程中存在步骤繁杂，检测效率低的问题。因此，如何提供一种新的BRAF基因突变检测方法及试剂盒，简化实验步骤，
提高实验效率，是BRAF基因检测领域亟需解决问题之一。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测BRAF基因的引物、试剂盒及检测方法，本专利技术设计检测的BRAF基因的引物，能够在同一反应体系中进行PCR扩增后的切割和连接反应，简化了建库实验步骤，提高检测效率，有效解决现有技术中步骤繁杂，检测效率低的问题，适合大范围推广应用。
[0009]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种用于检测BRAF基因的引物，所述引物用于扩增BRAF基因目标区域；
[0011]所述引物中至少有一个引物上含有可断裂位点和/或可切除序列；
[0012]所述可断裂位点包括核糖核苷酸；
[0013]所述可切除序列包括RNA序列和/或限制性内切酶识别序列。
[0014]本专利技术中，巧妙设计用于检测BRAF基因的引物，在对BRAF基因中的目标区域进行扩增后，将可断裂位点或可切除序列带入扩增产物中，使得扩增产物在后续的切割和连接能够在同一个反应体系中进行，简化了BRAF基因突变检测的步骤，提高了检测效率。
[0015]优选地，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。
[0016]优选地，所述引物的核酸序列还包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。
[0017]SEQ ID NO.1(5
’‑3’
)：AGCCTCAATTCTTACCATCCACA。
[0018]SEQ ID NO.2(5
’‑3’
)：CGGUTGCTTGCTCTGATAGGAAAATGA。
[0019]SEQ ID NO.3(5
’‑3’
)：AACTCAGCAGCATCTCAGGG。
[0020]SEQ ID NO.4(5
’‑3’
)：GCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGG。
[0021]本专利技术中，同时使用两对引物(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4)时，SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4为外引物对，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为内引物对，它们配合使用能够减少扩增所需的待测序样本量，并提高扩增的特异性。
[0022]第二方面，本专利技术提供第一方面所述的用于检测BRAF基因的引物在制备检测BRAF基因的产品中的应用。
[0023]第三方面，本专利技术提供一种检测BRAF基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测BRAF基因的引物。
[0024]优选地，所述试剂盒还包括断裂剂、第一接头、第二接头、连接酶和连接酶缓冲液；
[0025]优选地，所述断裂剂用于对所述用于检测BRAF基因的引物的扩增产物中的可断裂位点和/或可切除序列进行切割，形成第一粘性末端；
[0026]优选地，所述第一接头含有与所述第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；
[0027]优选地，所述第二接头的一端为单碱基突出末端；
[0028]优选地，所述单碱基突出末端为T，其位于3
’
端。
[0029]本专利技术中，所述第一粘性末端的长度不限，优选在1
‑
6bp之间，此时，第一粘性末端与互补配对的接头的连接反应效率较高，更优选为4bp或5bp，此时连接反应的效率最高。
[0030]根据用于扩增每个目标区域的BRAF特异性引物中含有可断裂位点或可切除序列的引物种类数量的不同，以下将分别进行阐述。
[0031]在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测BRAF基因的引物，其特征在于，所述引物用于扩增BRAF基因目标区域；所述引物中至少有一个引物上含有可断裂位点和/或可切除序列；所述可断裂位点包括核糖核苷酸；所述可切除序列包括RNA序列和/或限制性内切酶识别序列。2.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因的引物，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。3.权利要求1或2所述的用于检测BRAF基因的引物在制备检测BRAF基因的产品中的应用。4.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测BRAF基因的引物；优选地，所述试剂盒还包括断裂剂、第一接头、第二接头、连接酶和连接酶缓冲液；优选地，所述断裂剂用于对所述用于检测BRAF基因的引物的扩增产物中的可断裂位点和/或可切除序列进行切割，形成第一粘性末端；优选地，所述第一接头含有与所述第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；优选地，所述第二接头的一端为单碱基突出末端；优选地，所述单碱基突出末端为T，其位于3
’
端。5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述第一接头为双链核酸分子；优选地，所述第二粘性末端所在链的5
’
末端含生物素标记；优选地，所述第二接头为双链核酸分子，所述单碱基突出末端所在链的5
’
末端含生物素标记；优选地，所述第一接头的核酸序列包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列；优选地，所述第二接头的核酸序列包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO.8所示的序列；优选地，所述断裂剂包括RNase H、USER酶或限制性内切酶。6.一种以非疾病诊断治疗目...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，张晓英，黄思强，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：