一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针及其应用，所述引物探针序列分别为目的基因上游引物序列FZD2‑F：SEQ ID No:1 5’‑GTGTGGCAGTTCAGCCCTAT‑3’、目的基因下游引物序列FZD2‑R：SEQ ID No:2 5’‑AATGTGTGCCACGAAACTGC‑3’、目的基因探针序列FZD2‑P：SEQ ID No:3 5’‑FAM‑GGCTGATGGCTCGCGCTGGGCA‑BHQ1‑3’、内参基因上游引物序列EFTUD2‑F：SEQ ID No:4 5’‑CTCAAAGTGCGGGGACTGAT‑3’、内参基因下游引物序列EFTUD2‑R：SEQ ID No:5 5’‑GGCATCAGGGTGACTCCAAA‑3’、内参基因探针序列EFTUD2‑P：SEQ ID No:6 5’‑HEX‑AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT‑BHQ1‑3’。上述引物探针用于数字PCR试剂盒，试剂盒能快速、特异、灵敏地检测HER2基因扩增。该试剂盒一步法扩增方法简单、成本低廉，非常适用于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等各种样本中的基因拷贝数变异情况，适合大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针及其应用
本专利技术属于肿瘤分子检测
，具体涉及一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针及其应用。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，高居女性肿瘤发病率第一位，占据女性居民死亡原因的第一位，给家庭和社会造成巨大的精神和经济负担。不同肿瘤患者对靶向药物的治疗效果以及由此导致的预后存在很大差异。因此对肿瘤病人进行相关基因突变的动态检测可以精准指导临床选择合适的靶向药物。HER2(ERBB2)为人类表皮生长因子受体(EGFR)的家族成员，是一种原癌基因。超过30％的人类肿瘤广泛存在HER-2基因扩增/过表达，HER2基因扩增/过表达不仅与肿瘤的发生发展相关，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，并且是肿瘤靶向治疗的一个重要靶点。约15-30％的乳腺癌患者中存在HER2基因扩增。对于HER2阳性肿瘤而言，HER2基因的高度表达可导致HER2蛋白的过表达，从而刺激癌细胞疯狂增长，侵袭性增加，复发和转移相对较快。因此，HER2阳性肿瘤往往恶性程度较高，常规化疗治疗效果较差，预后不良。目前，针对HER2阳性的乳腺癌已有靶向治疗方案，靶向治疗药物有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼等。以最早使用也是最成功的曲妥珠单抗(赫赛汀)为例，临床研究表明，曲妥珠单抗可显著延长HER2阳性乳腺癌患者的PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)。曲妥珠单抗联合化疗能将肿瘤的复发风险降低52％，将患者的死亡风险降低33％。目前HER2基因扩增检测已列入NCCN推荐的乳腺癌靶向治疗分子标记物。传统的HER2基因检测方法有免疫组织化学(IHC)检测HER2蛋白的表达水平、原位杂交法检测HER2基因扩增水平等。这些方法依赖于肿瘤组织，取材繁琐，无法做到动态检测。数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，能够检测低丰度的肿瘤DNA变异，降低假阴性结果，特别适应于液体活检领域(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。因此，开发相关利用数字PCR技术对乳腺癌复发转移基因HER2扩增检测，有利于病程动态跟踪和药物预后监控，大幅度减轻因用药不及时或过度治疗给患者造成的健康损害及对个人、家庭及国家医疗保健体系造成的经济压力和负担，对我市经济、社会和科技发展有巨大的利益。
技术实现思路
本专利技术目的是提供基于数字PCR技术检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针及其应用，为实现本专利技术目的，使用如下的技术方案：一种基于数字PCR技术检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针，所述数字PCR引物探针由具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物探针组成，序列为：目的基因上游引物序列HER2-F：5’-GTGTGGCAGTTCAGCCCTAT-3’SEQIDNO:1；目的基因下游引物序列HER2-R：5’-AATGTGTGCCACGAAACTGC-3’SEQIDNO:2；目的基因探针序列HER2-P：5’-FAM-GGCTGATGGCTCGCGCTGGGCA-BHQ1-3’SEQIDNO:3；内参基因上游引物序列EFTUD2-F：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’SEQIDNO:4；内参基因下游引物序列EFTUD2-R：5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’SEQIDNO:5；内参基因探针序列EFTUD2-P：5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’SEQIDNO:6。优选的，所述的目的基因引物探针是依据人基因HER2的基因编码区域设计的，内参基因引物探针是依据人EFTUD2基因区域设计的，扩增的目的片段大小分别为102bp和109bp，扩增序列(102bp)为：5’-GTGTGGCAGTTCAGCCCTATGCCCCATGGCTGATGGCTCGCGCTGGGCAGGTATGCAGGGCTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCAGTTTCGTGGCACACATT-3’。扩增序列(109bp)为：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGATTGTTAGCTCTAAAAGCTCTGGCACTATAGATAGTGATAGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCTAGAAGATTTGGAGTCACCCTGATGCC-3’。优选的，所述的数字PCR引物探针在制备检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增检测试剂盒的应用。本专利技术还提供一种检测HER2基因扩增的数字PCR试剂盒，包括具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物探针。试剂盒的使用方法包括如下步骤：(1)配制数字PCR反应液；数字PCR反应液20μl配方为：一步法反应缓冲液4μl，酶混合液2μl，10μMHER2-F、HER2-R、EFTUD2-F和EFTUD2-R引物各1.2μl，10μMHER2-P和EFTUD2-P各0.6μl，待测样品DNA模板为8μl；(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。本专利技术试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；待测样本结果判定：(1)阳性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；(3)疑似阳性：1.8<目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<2.2。本专利技术依据HER2基因区域设计了一对特异性引物及探针，同时以人EFTUD2基因区域为内参对照设计了一对引物及探针，建立了基于数字PCR技术的检测方法，其优势有：(1)高灵敏度：检测灵敏度达到10万个正常DNA分子中检测到一个HER2扩增分子，适合液体活检样本(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。(2)高特异性：本专利技术针对HER2基因区域设计的特异性引物探针能特异性检测出HER2基因的拷贝数变化，不与其他同源基因相互干扰。(3)可排除复杂样本对实验结果的干扰：不受PCR抑制物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针，其特征在于，所述引物探针序列分别为：/n目的基因上游引物序列FZD2-F：SEQ ID No:1 5’-GTGTGGCAGTTCAGCCCTAT-3’、/n目的基因下游引物序列FZD2-R：SEQ ID No:2 5’-AATGTGTGCCACGAAACTGC-3’、/n目的基因探针序列FZD2-P：SEQ ID No:3 5’-FAM-GGCTGATGGCTCGCGCTGGGCA-BHQ1-3’、/n内参基因上游引物序列EFTUD2-F：SEQ ID No:4 5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’、/n内参基因下游引物序列EFTUD2-R：SEQ ID No:5 5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’、/n内参基因探针序列EFTUD2-P：SEQ ID No:6 5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测乳腺癌复发转移基因HER2扩增的引物探针，其特征在于，所述引物探针序列分别为：
目的基因上游引物序列FZD2-F：SEQIDNo:15’-GTGTGGCAGTTCAGCCCTAT-3’、
目的基因下游引物序列FZD2-R：SEQIDNo:25’-AATGTGTGCCACGAAACTGC-3’、
目的基因探针序列FZD2-P：SEQIDNo:35’-FAM-GGCTGATGGCTCGCGCTGGGCA-BHQ1-3’、
内参基因上游引物序列EFTUD2-F：SEQIDNo:45’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’、
内参基因下游引物序列EFTUD2-R：SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，张晓英，黄思强，朱涛，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44