一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用，所述引物探针序列分别为目的基因上游引物序列FZD2‑F：SEQ ID No:1 5’‑TTTCTGTCGGGCTGCTACAC‑3’、目的基因下游引物序列FZD2‑R：SEQ ID No:2 5’‑GTAACCGTCCTCGGAGAAGC‑3’、目的基因探针序列FZD2‑P：SEQ ID No:3 5’‑FAM‑GCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCA‑BHQ1‑3’、内参基因上游引物序列EFTUD2‑F：SEQ ID No:4 5’‑CTCAAAGTGCGGGGACTGAT‑3’、内参基因下游引物序列EFTUD2‑R：SEQ ID No:5 5’‑GGCATCAGGGTGACTCCAAA‑3’、内参基因探针序列EFTUD2‑P：SEQ ID No:6 5’‑HEX‑AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT‑BHQ1‑3’。上述引物探针用于数字PCR试剂盒。本发明专利技术试剂盒能快速、特异、灵敏地检测FZD2基因扩增，该试剂盒一步法扩增方法简单、成本低廉，非常适用于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等各种样本中的基因拷贝数变异情况，适合大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用
本专利技术属于肿瘤分子检测
，具体涉及一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用。
技术介绍
神经母细胞瘤(GBM)已被世界卫生组织指定为IV级癌症，是成人中最常见和致命的CNS肿瘤。目前，针对GBM患者的标准治疗包括最大程度的手术切除，然后同时进行放疗和化疗。Temozolomide(Temodal)是一种DNA烷基化剂，是最常用的化学治疗剂。尽管有这些疗法，大多数患者最终还是复发了。因此，迫切临床需要开发有效的抗GBM治疗剂。GBM患者的预后普遍较差。GBM肿瘤具有高度异质性。另一方面，GBM似乎也具有细胞层次结构，因此存在一个GBM细胞亚群，该亚群富含肿瘤发生和扩散的能力，这些细胞驱动肿瘤的生长和治疗耐药性。大量研究表明，WNT信号在GBM中被异常激活，并且它通过维持干细胞特性来促进GBM的生长和侵袭。WNT蛋白是一类高度保守的分泌信号分子。自1982年在小鼠乳腺癌模型中发现WNT信号作为致癌基因以来，已有30种WNT信号作为细胞间相互作用，细胞命运决定和迁移的关键调节剂出现。WNT途径成分的突变会导致特定的发育缺陷，而异常的WNT信号传导往往会导致癌症。WNT蛋白与细胞表面上卷曲的(FZD)和低密度脂蛋白受体相关蛋白/α2-巨球蛋白受体(LRP)家族的受体结合。WNT配体分子与受体(FZD2等)结合之后，可激活下游通路，导致转录因子β-Catenin稳定并转入细胞核，最终通过转录调控调节众多靶基因的表达。FZD2是GBM的一个重要靶点，它的扩增可能成为GBM诊断和预后的重要指标。数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，能够检测低丰度的肿瘤DNA变异，降低假阴性结果，特别适应于液体活检领域(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。因此，开发相关利用数字PCR技术对神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增检测，有利于病程动态跟踪和药物预后监控，大幅度减轻因用药不及时或过度治疗给患者造成的健康损害及对个人、家庭及国家医疗保健体系造成的经济压力和负担，对经济、社会和科技发展有巨大的利益。
技术实现思路
本专利技术目的是提供基于数字PCR技术检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用，为实现本专利技术目的，使用如下的技术方案：一种基于数字PCR技术检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针，所述数字PCR引物探针由具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物探针组成，序列为：目的基因上游引物序列FZD2-F：5’-TTTCTGTCGGGCTGCTACAC-3’SEQIDNO:1、目的基因下游引物序列FZD2-R：5’-GTAACCGTCCTCGGAGAAGC-3’SEQIDNO:2、目的基因探针序列FZD2-P：5’-FAM-GCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCA-BHQ1-3’SEQIDNO:3、内参基因上游引物序列EFTUD2-F：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’SEQIDNO:4、内参基因下游引物序列EFTUD2-R：5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’SEQIDNO:5、内参基因探针序列EFTUD2-P：5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’SEQIDNO:6。优选的，所述的目的基因引物探针是依据人基因FZD2的基因编码区域设计的，内参基因引物探针是依据人EFTUD2基因区域设计的，扩增的目的片段大小分别为102bp和109bp，扩增序列(102bp)为：5’-TTTCTGTCGGGCTGCTACACCATGGTGTCGGTGGCCTACATCGCGGGCTTCGTGCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCAACGAGCGCTTCTCCGAGGACGGTTAC-3’、扩增序列(109bp)为：5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGATTGTTAGCTCTAAAAGCTCTGGCACTATAGATAGTGATAGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCTAGAAGATTTGGAGTCACCCTGATGCC-3’。优选的，所述的数字PCR引物探针在制备检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增检测试剂盒的应用。本专利技术还提供一种检测FZD2基因扩增的数字PCR试剂盒，包括具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:6所示核苷酸序列的引物探针。试剂盒的使用方法包括如下步骤：(1)配制数字PCR反应液；数字PCR反应液20μl配方为：一步法反应缓冲液4μl，酶混合液2μl，10μMFZD2-F、FZD2-R、EFTUD2-F和EFTUD2-R引物各1.2μl，10μMFZD2-P和EFTUD2-P各0.6μl，待测样品DNA模板为8μl；(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。本专利技术试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性对照：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；待测样本结果判定：(1)阳性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数>2.2；(2)阴性：目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<1.8；(3)疑似阳性：1.8<目的基因拷贝数/内参基因拷贝数<2.2。本专利技术依据FZD2基因区域设计了一对特异性引物及探针，同时以人EFTUD2基因区域为内参对照设计了一对引物及探针，建立了基于数字PCR技术的检测方法，其优势有：(1)高灵敏度：检测灵敏度达到10万个正常DNA分子中检测到一个FZD2扩增分子，适合液体活检样本(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。(2)高特异性：本专利技术针对FZD2基因区域设计的特异性引物探针能特异性检测出FZD2基因的拷贝数变化，不与其他同源基因相互干扰。(3)可排除复杂样本对实验结果的干扰：不受PCR抑制物的影响，可避免样本复杂性导致的PCR假阴性，适用于体液样本。附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针，其特征在于，所述引物探针序列分别为：/n目的基因上游引物序列FZD2-F：SEQ ID No:1 5’-TTTCTGTCGGGCTGCTACAC-3’、/n目的基因下游引物序列FZD2-R：SEQ ID No:2 5’-GTAACCGTCCTCGGAGAAGC-3’、/n目的基因探针序列FZD2-P：SEQ ID No:3 5’-FAM-GCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCA-BHQ1-3’、/n内参基因上游引物序列EFTUD2-F：SEQ ID No:4 5’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’、/n内参基因下游引物序列EFTUD2-R：SEQ ID No:5 5’-GGCATCAGGGTGACTCCAAA-3’、/n内参基因探针序列EFTUD2-P：SEQ ID No:6 5’-HEX-AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT-BHQ1-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针，其特征在于，所述引物探针序列分别为：
目的基因上游引物序列FZD2-F：SEQIDNo:15’-TTTCTGTCGGGCTGCTACAC-3’、
目的基因下游引物序列FZD2-R：SEQIDNo:25’-GTAACCGTCCTCGGAGAAGC-3’、
目的基因探针序列FZD2-P：SEQIDNo:35’-FAM-GCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCA-BHQ1-3’、
内参基因上游引物序列EFTUD2-F：SEQIDNo:45’-CTCAAAGTGCGGGGACTGAT-3’、
内参基因下游引物序列EFTUD2-R：SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，张晓英，黄思强，朱涛，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44