与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用。本发明专利技术采用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统，在人肺癌细胞系中，发现TMEM116基因与肺癌的转移和增殖有密切关系，本发明专利技术设计TMEM116基因敲除sgRNA，通过脂转法获得敲降TMEM116基因的肺癌细胞系。在此基础上，通过小鼠体外和体内实验，发现TMEM116敲降的肺癌细胞的致癌能力和转移能力明显降低，阐明TMEM116基因与肺癌之间的关系，以及发现了TMEM116基因可以作为肺癌增殖和转移相关的分子标志物，用于肺癌的诊断，为肺癌的诊断和治疗提供新的方法。

【技术实现步骤摘要】
与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用
本专利技术涉及医学分子生物学领域，特别是肺癌诊断
，具体涉及与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用。
技术介绍
由于吸烟、空气污染及一些化学因子的刺激，人体的正常肺细胞收到损伤，在机体损伤修复的过程中易发生基因突变，进而导致肿瘤和癌症的发生。目前，肺癌也是最常见的恶性肿瘤之一，占全球癌症死亡人数的18.4％。肺癌是一种高度复杂的肿瘤，预后通常较严重，5年生存率只有15％。另外，在代谢变化和免疫逃避的促进下，肺癌细胞易通过血管和淋巴管向其他器官转移，形成继发性肿瘤。由于癌细胞的恶性增生和转移是患者发病和预后生存的关键，因此找到检测肺癌增生和转移的基因指标或分子标志物具有重要意义。TMEM(Transmembraneprotein)家族，是一种跨越生物膜的蛋白，它允许细胞与细胞、细胞与环境之间的交流，是一个庞大的家族。TMEM家族蛋白在人类机体中的生物学功能非常广泛。近年来，多项临床研究发现TMEM家族成员在癌症组织中表达量发生变化，但不同TMEM家族成员在不同组织中的变化并不相同，同时也并非所有的TMEM家族成员都与癌症的发生和发展相关。对于TMEM116基因的功能以及与癌症的关系，目前尚无报道。若能通过对TMEM116的研究,发掘与肺癌增殖和转移相关的新型分子标志物，将为未来开发肺癌发生的早期诊断和治疗药物提供新方法和途径。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供TMEM16基因在参与肺癌细胞增殖和转移中的应用，进而提供与肺癌诊断相关的分子标志物。本专利技术的第二个目的是提供肺癌的诊断试剂盒。本专利技术的第三个目的是提供一种潜在的具有阻止肺癌细胞增殖、浸润和迁移能力的药物。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：收集肺癌组织和肺癌细胞系，检测相关基因的表达情况，发现TMEM116基因在肺癌组织和肺癌细胞中表达量显著提高。在肺癌细胞A549中敲除TMEM116，以检测肺癌细胞的功能变化。通过CRISPR/Cas9技术，成功构建TMEM116敲降人肺癌A549细胞系。体外迁移和浸润实验表明，TMEM116的缺失显著抑制A549细胞的迁移和浸润能力。体外增殖和癌细胞克隆形成实验表明，TMEM116的缺失显著抑制A549细胞的增殖和克隆形成。以上结果表明，TMEM116与肺癌的增殖和迁移有密切关系，检测TMEM116基因表达变化可作为肺癌发生和发展的诊断指标。基于本专利技术的发现，第一方面，本专利技术提供了TMEM116基因在肺癌细胞的转移、浸润和/或增殖中的应用。本专利技术提供了TMEM116基因的表达抑制剂在制备抑制肺癌细胞转移、浸润和/或增殖的药物中的应用。所述的表达抑制剂为抑制或降低TMEM116基因在细胞中表达量的生物制剂或化学制剂，所述生物制剂为RNAi、转录抑制剂、转录后加工抑制剂、转录加工成熟后的功能抑制剂或通过基因敲除或敲降的方法抑制或降低TMEM116基因在细胞中表达的DNA片段、sgRNA。优选地，所述的sgRNA序列，其DNA序列为ACGGGTGCGCTTCTACCCAG，如SEQIDNO.1所示。第二方面，本专利技术提供了TMEM116基因作为诊断标志物在制备肺癌诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。本专利技术提供了检测TMEM116基因表达量的试剂在制备肺癌诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。本专利技术提供了检测TMEM116基因表达量的试剂在制备肺癌治愈评价体系中的应用。所述的试剂含有检测TMEM116基因表达量的引物和/或探针。上述的应用，仅通过检测待测样本基因组中TMEM116基因表达水平来判断，当待测样品基因组中TMEM116基因表达水平与阴性对照差异显著，与阳性对照差异不显著，待测组织为肺癌组织或肺癌细胞浸润或转移的组织；所述阴性对照为正常组织或癌旁组织，所述阳性对照为肺癌组织。第三方面，本专利技术提供了一种肺癌诊断试剂盒或肺癌细胞浸润或转移的检测试剂盒，含有在肿瘤组织或肿瘤胞外基质中检测TMEM116蛋白表达量的检测试剂。第四方面，本专利技术提供了特异靶向TMEM116基因的sgRNA，其DNA序列为ACGGGTGCGCTTCTACCCAG，如SEQIDNO.1所示。含有上述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体属于本专利技术的保护范围。所述的CRISPR/Cas9打靶载体，含有药物筛选标记G418。本专利技术提供了所述的CRISPR/Cas9打靶载体在特异识别和靶向修饰TMEM116中的应用。本专利技术提供了所述的CRISPR/Cas9打靶载体在TMEM116基因敲降细胞系或模型动物中的应用。本专利技术实施例中所述的TMEM116基因的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次发现相较于正常细胞分泌的TMEM116蛋白的表达水平，肺癌细胞的TMEM116蛋白的表达水平显著提高，具有指示肺癌的诊断能力，可以辅助传统肺癌检测方法，确定病理样本是否来自肺癌组织。进一步，本专利技术经过基因编辑技术CRISPR/Cas9系统，在人肺癌细胞系中，发现TMEM116基因与肺癌的转移和增殖有密切关系，TMEM116基因敲除sgRNA，通过脂转法获得敲降TMEM116基因的肺癌细胞系。在此基础上，通过小鼠体外和体内实验，发现TMEM116敲降的肺癌细胞的致癌能力和转移能力明显降低。该发现为肺癌的治疗药物的研发提供了新的思路，可研制TMEM116表达抑制剂，用于制备抑制肺癌细胞增殖、浸润或转移的药物，以治疗肺癌。附图说明图1为肺癌病人的肺组织中TMEM116基因的表达情况。上图为肺腺癌组织，下图为肺鳞癌组织，TMEM116在肺腺癌和肺鳞癌组织的气道上皮、间质和肿瘤区域的表达情况。CC10、β-tubulin是上皮克拉拉细胞和纤毛细胞的标记蛋白，α-SMA是间质细胞的标记蛋白。图2为正常人肺细胞系和肺癌细胞系中TMEM116的表达情况。16HBE为人肺气管上皮细胞系，A549，H1299，H441为人肺癌细胞系。图3为针对TMEM116基因设计的不同靶点转染细胞后的序列比对峰图。第一排为靶点1转染细胞后提取DNA，PCR进行测序后的峰图，第二排为靶点2转染细胞后提取DNA，PCR进行测序后的峰图，第三排为靶点3转染细胞后提取DNA，PCR进行测序后的峰图。图4为TMEM116敲降人肺癌细胞中TMEM116基因和翻译水平的检测。A图为检测TMEM116在两个敲除细胞系中蛋白的表达水平，并进行灰度分析。B图为检测两个细胞系的TMEM116基因序列，第一排为正常细胞系中TMEM116基因序列，后两排为敲除细胞系中的基因序列，可发现为单基因敲除细胞系，命名为敲降细胞系。图5为TMEM116体外检测敲降细胞系的功能。A图为敲降细胞的迁移和浸润的能力检测，迁入下层的细胞越多说明能力越强。B图为敲降细胞的增殖能力检测，吸光度值越高，表明增殖能力越强。C图为克隆形成能力检测，克隆形成越多和越大，表明克隆形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TMEM116基因在肺癌细胞的转移、浸润和/或增殖中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.TMEM116基因在肺癌细胞的转移、浸润和/或增殖中的应用。


2.TMEM116基因的表达抑制剂在制备抑制肺癌细胞转移、浸润和/或增殖的药物中的应用。


3.权利要求2所述的表达抑制剂为抑制或降低TMEM116基因在细胞中表达量的生物制剂或化学制剂，所述生物制剂为RNAi、转录抑制剂、转录后加工抑制剂、转录加工成熟后的功能抑制剂或通过基因敲除或敲低的方法抑制或降低TMEM116基因在细胞中表达的DNA片段、sgRNA。


4.TMEM116基因作为诊断标志物在制备肺癌诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。


5.检测TMEM116基因表达量的试剂在制备肺癌诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。


6.检测TMEM116基...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢怡明，张苏红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11