一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术针对COVID‑19中ORF1ab基因区域设计引物对和探针，能够特异性地检测出新型冠状病毒，使用所述引物探针组合制备的试剂盒，配合数字PCR技术同时使用，能够对样本进行绝对定量，检测灵敏度高，检测结果还可以排除复杂样本对于实验结果的干扰，准确度高。

Detection novel coronavirus primer probe combination based on digital PCR and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种检测新型冠状病毒(COVID-19)的引物探针组合及其应用，尤其涉及一种基于数字PCR检测COVID-19的引物探针组合及其应用。
技术介绍
新型冠状病毒(COVID-19)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60～140nm，属于网巢病毒目冠状病毒科乙型冠状病毒属。此病毒基因组长度约30kb左右，其基因序列显示与中华菊头蝠中发现的冠状病毒相似，例如MERS-CoV或SARS-CoV，与SARS-CoV同属于乙型冠状病毒属谱系β(BetacoronavirusLineageβ，Sarbecovirus)。新型冠状病毒肺炎的临床表现为以发热、乏力、干咳为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。新型冠状病毒被认为对人群普遍易感，其可通过包括呼吸道飞沫、飞沫形成的气凝胶、皮肤接触或直接接触带有病毒的分泌物进行传播，可从包括眼睛、鼻腔、口腔进入人体。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。为了及时发现人群中病毒携带者，有效控制病毒在人群中的传播，建立快速、敏感、准确的新型冠状病毒检测方法是十分必要的。目前临床上用于检测新冠病毒核酸的方法主要为实时荧光RT-PCR，依赖于Taqman探针技术的实时荧光RT-PCR虽然具有高特异性和敏感性，但其定量依赖于标准物质，要求样本中目的基因的扩增效率与标准物质一致，定量准确性易受样本基质及干扰物质的影响，同时其检测下限仍很高，暂时不能检测出微量的病毒。数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为“1”，没有荧光信号的微滴判读为“0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，实现了真正意义上的绝对定量。与实时荧光PCR相比，该方法具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，使得其能够有效检测临床样本中低载量的病毒核酸，降低假阴性结果。因此，开发相关利用数字PCR对新型冠状病毒(COVID-19)进行绝对定量的检测方法和试剂盒对流行病学调查、疫情监控、口岸检验检疫以及卫生保障领域具有重大意义。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用，依据新型冠状病毒ORF1ab区域中RNA聚合酶(RdRp)基因区域设计了一对特异性引物及探针，同时建立了基于数字PCR技术的检测方法。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中的引物对如SEQIDNO.1～2所示，所述引物探针组合中的探针如SEQIDNO.3所示。本专利技术针对新型冠状病毒(COVID-19)ORF1ab基因区域设计的特异性引物探针能检测出新型冠状病毒，其中ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制，同时所述引物探针组合对于与新冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物等无交叉反应，特异性较好。作为本专利技术优选的技术方案，所述引物探针组合用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因。优选地，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。优选地，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种。优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。本专利技术中，所述引物探针组合的具体序列如表1所示：表1优选地，所述引物探针组合还包括检测内参基因的引物对和探针。优选地，所述内参基因包括人RPPH1基因。优选地，所述人RPPH1基因的引物对如SEQIDNO.4～5所示。优选地，所述人RPPH1基因的探针如SEQIDNO.6所示。优选地，所述内参基因的探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。优选地，所述用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的探针的荧光基团与所述内参基因的探针的报告荧光基团不同。本专利技术中，所述内参基因的引物对和探针的具体序列如表2所示：表2本专利技术中，所述的目的基因引物探针是依据新型冠状病毒ORF1ab基因区域设计的，内参基因引物探针是依据人RPPH1基因区域设计的，扩增的目的片段大小分别为SEQIDNO.7(111bp)和SEQIDNO.8(87bp)。扩增序列SEQIDNO.7为：5′-GACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTGTGATGCCATGCGA-3′扩增序列SEQIDNO.8为：5′-CTGGCCCTAGTCTCAGACCTTCCCAAGGGACATGGGAGTGGAGTGACAGGACGCACTCAGCTCGTGGCCCCACTGATGAGCTTCCCT-3′第二方面，如第一方面所述的引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。第三方面，本专利技术还提供一种基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物探针组合。本专利技术提供的试剂盒配合数字PCR，能够实现对待测样本中目的基因的绝对定量，其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非Ct值，所得结果较为准确，能够为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据。优选地，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。本专利技术中，所述阳性对照品中含有新型冠状病毒中包含RdRP基因的一段核苷酸序列、和内参基因人RPPH1的核苷酸序列；阴性对照品中仅包含内参基因的核苷酸序列。添加阳性对照品和阴性对照品能够进一步验证试剂盒的检测结果是否可靠，确认在使用试剂盒过程中是否有其他元素的干扰。第四方面，一种如第三方面所述的新型冠状病毒检测试剂盒的使用方法，包括步骤如下：将待测样品、所述的引物探针组合、酶和反应缓冲液混合，制备微滴，然后将微滴转入PCR仪中进行扩增，再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，分析数据，得到所述待测样品的检测结果。所述试剂盒的使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQIDNO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因；
优选地，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团；
优选地，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种；
优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。


3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括检测内参基因的引物对和探针；
优选地，所述内参基因包括人RPPH1基因；
优选地，所述人RPPH1基因的引物对的核酸序列如SEQIDNO.4～5所示；
优选地，所述人RPPH1基因的探针的核酸序列如SEQIDNO.6所示。


4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述内参基因的探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团；
优选地，所述用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的探针的报告荧光基团与所述内参基因的探针的报告荧光基团不同。


5.如权利要求1-4任一项所述的引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。


6.一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。


8.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓英，黄思强，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44