本发明专利技术涉及病毒核酸检测方法技术领域，具体为一种SARS‑CoV‑2的RT‑LAMP核酸检测引物组，以及一种封闭式SARS‑CoV‑2等温扩增核酸检测试剂盒。本发明专利技术试剂盒，针对咽拭子样本的病毒RNA无需核酸提取，可直接对样本进行扩增，是一种对SARS‑CoV‑2一步法可视化即时筛查试剂盒，特异性好，能排除其他冠状病毒株的非特异性干扰，快速高效，能在1小时内完成检测，且无需大型昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低，整个过程不涉及有毒试剂，封闭操作，避免二次污染，保证了操作人员及环境的安全。
A closed isothermal amplification nucleic acid detection kit for sars-cov-2
【技术实现步骤摘要】
一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒
本专利技术涉及病毒核酸检测方法
，尤其涉及一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，以及一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒。
技术介绍
随着《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》的发布，核酸检测作为诊断的重要标准，其重要性得到了普遍认可。然而核酸检测涉及到提取、扩增、检测等环节，对实验室环境和操作人员要求较高，一个完整的新冠病毒核酸检测程序往往需要专业测试人员连续3小时以上的双手离台操作，涉及大型的荧光定量PCR仪，因此核酸检测的普及和现场应用受到限制，进而导致了大量有临床症状的病人不能够及时得到确诊和针对性的治疗。截至2020年2月22日，国内报道研制出SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的企业超过100家，国家药监局应急批准了上海之江、圣湘生物、上海捷诺等7个核酸检测试剂盒产品上市。这些产品具有如下特点：(1)超过90％都是核酸诊断试剂盒形式，需经过提取、扩增和检测，操作繁琐，且需要专业人员和复杂的P2实验室，难以实现新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的现场实时检测；(2)多数采用qPCR方法，由于涉及到升降温循环，因此检测时间较长(4h左右)，不利于现场快速检测；(3)2020年2月16日科技部推荐两个核酸检测产品纳入药监局应急审批通道(杭州优思达和上海仁度)，两个产品均采取等温扩增方式，说明等温扩增技术在新型冠状病毒肺炎检测中的重要作用。但以上公司研发的等温扩增试剂盒尚未实现免核酸提取的步骤。因此，研发出免核酸提取、封闭式、可视化等温扩增快速核酸检测试剂盒，突破现有核酸检测方法对大型检测仪器和特殊场所的限制，能够有效防止二次污染，缩短检测用时，提高判读便捷性和检测灵敏度，为SARS-COV-2诊断提供一种关键的技术解决方案，对新型冠状病毒肺炎疫情的防控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的核酸检测技术问题，根据目前发布的新型冠状病毒的序列，(WuhanseafoodmarketpneumoniavirusisolateWuhan-Hu-1,completegenomeGenBank:MN908947.3)全长为29903bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer软件设计特异性引物组，利用环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术扩增靶基因的特定区域，从而提供一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，从分子水平上实现快速检测，为SARS-CoV-2检测提供了有效且快速的检测方法，具有广阔的前景和较大的社会效益。本专利技术的第一目的在于提供一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，即SARS-CoV-2的等温扩增核酸检测引物组，利用SARS-CoV-2的特定区域，进行环介导等温扩增，能够快速、特异地实现SARS-CoV-2的扩增。本专利技术的第二目的在于提供一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，其利用上述的RT-LAMP核酸检测引物组进行环介导等温扩增，减少核酸提取过程，利用可视化研判方式实现SARS-CoV-2的核酸快速检测。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，所述引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；所述F3-1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC3’；所述B3-1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT3’；所述FIP-1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5’CACATAATAAGCTGCAGCACCA-TACATAGAAGTTATTTGACTCCTGG3’；所述BIP-1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：5’ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGAG3’；所述LF-1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：5’GCTGTCCAACCTGAAGAAGAATCA3’；所述LB-1的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：5’AGACTGTGCACTTGACCCTC3’。一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液A、反应预混液B、显色剂、检测管、标准阳性模板、阴性对照；主要包括以下物质：1)BstDNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)10X反应缓冲液；4)显色剂；5)密封液；6)标准阳性模板；7)阴性对照；8)以上所述的引物组；9)甲酰胺。优选的，所述显色剂为HNB。更优选的，所述显色剂为3mM的HNB溶液。优选的，所述甲酰胺选用浓度为5-8wt％的甲酰胺溶液。更优选的，所述甲酰胺选用浓度为6wt％的甲酰胺溶液。优选的，所述反应预混液A包括BstDNA大片段聚合酶、AMV逆转录酶；所述反应预混液B包括10X反应缓冲液、以上所述的引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、6wt％甲酰胺和DEPC水。优选的，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:(2-6):(1-3)。更优选的，反应预混液B中所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。进一步地，所述标准阳性模板为SARS-CoV-2基因组片段；所述阴性对照为灭菌超纯水。以上所述的封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和显色结果判定：(1)待检样本：待检样本不需要提取RNA。可对咽拭子样本的病毒RNA直接扩增。(2)反应体系及条件：检测管中的反应体系含有：10Xbuffer反应液，BstDNA大片段聚合酶，AMV逆转录酶，引物组，显色剂，处理好的待检样本，甲酰胺，余量为超纯水；同时设置阳性对照和阴性对照，检测管内的溶液混匀后离心，50-70℃反应30-60min，并在85℃中断反应。进一步地，所述反应体系及条件(LAMP扩增，25μL)：引物组2.8μL(包括内引物1.6μM、外引物0.4μM、环引物0.8μM)，dNTP1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，BstDNA大片段聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，待检样本5μL，10XBuffer2.5μL，HNB染料1μL，6wt％甲酰胺1.5μL，无菌双蒸水补齐至25μL，63℃反应45min，85℃中断反应。(3)检测结果判断：根据检测管内反应体系的颜色判断检测结果，检测结果呈蓝色则检测结果判定为阳性，即检测样本中含有SARS-CoV-2；检测结果呈本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；/n所述F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述LF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种SARS-CoV-2的RT-LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B3-1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述FIP-1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP-1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述LF-1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述LB-1的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
2.一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液A、反应预混液B、显色剂、检测管、标准阳性模板、阴性对照，其特征在于，主要包括以下物质：1)BstDNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)10X反应缓冲液；4)显色剂；5)密封液；6)标准阳性模板；7)阴性对照；8)权利要求1所述的引物组；9)甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为HNB。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯铁英，胡雪姣，李杉，吴际，廖亚龙，郑有为，张雷，
申请(专利权)人：广东省人民医院广东省医学科学院，中山市华南理工大学现代产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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