一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。本发明专利技术设计了一组细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合，序列如SEQ ID NO：1‑6所示；并进一步构建了细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、引物和探针保守性高、特异性强、覆盖细小病毒B19不同的亚型或变种、有利于提高B19V检测的准确性和特异性、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩増而导致的相互抑制和干扰等问题、能够高效的监控整个PCR扩増整个过程、避免出现假阴性结果等优点，核酸DMA提取方法简单，核酸纯度高，成本较低，而且操作简便快速、成本低廉，特别适用于B19V精确的定量检测，可广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。

A kit for quantitative detection of parvovirus B19 nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒
本专利技术属于生物医学及临床诊断
更具体地，涉及一种细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒。
技术介绍
人细小病毒B19(humanparvovirusB19，简称B19V)是一种单链、线性DNA病毒，1977年才首次被发现。在人群中存在普遍的易感性，人群感染率达60％～70％以上，以冬春季常见。主要通过呼吸道、飞沫传播，也可通过血液和胎盘传播。在不同年龄和免疫状态的人群中临床表现不同，能引起感染性红斑胎儿水肿甚至死亡、急性关节炎、慢性贫血症、再生障碍性危象等多种病症。近年来较多的研究表明骨髓中红细胞、白细胞、血小板3系前体细胞均可成为B19V感染的靶细胞，受到病毒攻击导致全血细胞减少。然而，由于机体免疫功能低下，不能中和及消除感染的病毒，而造成病毒持续感染的时间久，影响血液病的治疗效果。镰状细胞贫血症等血液系统疾病患者感染会发生再生障碍性危象而导致急性贫血。因此，对于血液肿瘤及免疫性血液疾病，当出现治疗效果不显著时，建议检测B19V，对有B19V感染患者，加用免疫球蛋白治疗或者抗病毒药物治疗，以提高疗效。B19V是学龄儿童最常见的出疹性疾病-传染性红斑(又称第五病)的病原体。研究发现，我国川崎病患儿有较高的B19V感染率，可能是导致川崎病的主要病原体之一。婴幼儿免疫机制不完善，传统的免疫方法可能存在检测失效情况，核酸检测更为准确；若为阳性，指导临床合理用药，有利于患儿早日出院。或者用于与其他儿童出疹性疾病鉴别。妊娠期急性B19V感染的发生率约为1％～2％，在感染爆发流行时妊娠期妇女的感染率可上升至10％。由于B19V可以通过胎盘，孕妇感染B19V后可通过母胎垂直传播途径引起胎儿宫内感染。尽管大多数情况下胎儿宫内感染可自发缓解，不影响胎儿结局，但部分患者B19V宫内感染可导致胎儿水肿、死胎和自然流产等严重不良妊娠结局。美国妇产科医师协会不推荐常规对孕妇进行B19V血清学筛查(同HCMV)；确诊孕妇急性B19V感染后，应连续行超声检查动态监测胎儿有无水肿或贫血，胎儿出现严重贫血时应考虑宫内输血；PCR检测羊水B19VDNA可用于诊断胎儿是否存在B19V感染。因此，高灵敏性的B19V病毒核酸特异定量检测技术非常重要。
技术实现思路
本专利技术旨在从根本上解决现有细小病毒B19(B19V)核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，提供一种对细小病毒B19(B19V)检测灵敏度高、特异性强、稳定性重复性好的简便快速检测方法，适用于细小病毒B19(B19V)精确的定量检测。本专利技术的目的是提供一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合。本专利技术另一目的是提供一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合，包括如下组分，其序列如下：用于检测靶基因的探针为：5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3；用于扩增靶基因的下游引物为：5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3；用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。上述引物与探针组合在制备细小病毒B19检测产品方面的应用，以及含有所述引物与探针组合的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒，应在本专利技术的包含范围之内。即本专利技术提供一种含有所述引物与探针组合的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒。优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。更优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为8pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为8pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。另外，优选地所述试剂盒还包括B19V-PCR反应液、酶混合液、B19V定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述B19V-PCR反应液包括上述引物与探针组合和PCR缓冲液；所述PCR缓冲液组成为30mol/LpH8.3Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKC1，4.5mmol/LMgCl2,0.15mol/LdNTPs；所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份；所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆，B19V定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由B19V病毒血清样本稀释而成，浓度分别为5.0×105，5.0×104，5.0×103，5.0×102，1.0×102，1.0×105IU/ml，B19V病毒血清为灭活病毒血清样本。更优选地，所述试剂盒还包含内标，为人血DNA。另外，本专利技术的细小病毒B19核酸定量检测试剂盒除了包括上述B19V核酸扩増试剂盒外，还包括磁珠法核酸提取试剂盒；所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2-6.0mol/L，1-10mmol/LEDTA，所述EDTA的pH值为7.5；所述漂洗液组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/l00ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；所述洗脱液组成为含有10mmol/LTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.3，0.01-0.05％Prolin300；所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml；另外，优选地，本专利技术的细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒使用时的扩增程序为：50℃2min，1个循环；95℃9min，1个循环；95℃10s，58℃50s，45个循环，采集荧光信号；38℃5s，1个循环；38℃5sec，1个循环，冷却。本专利技术细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒的适用检测样本类型为血清和血浆。本专利技术上述细小病毒B19(B19V)核酸定量检测试剂盒的基本原理是：首先釆用纳米磁珠法提取血清、血浆样品中B19VDNA作为扩增模板，然后应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板实时荧光定量PCR检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合，其特征在于：包括如下组分：/n用于检测靶基因的探针为：5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；/n用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；/n用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3；/n用于扩增靶基因的下游引物为：5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3；/n用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；/n用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。/n

【技术特征摘要】
1.一种细小病毒B19核酸定量检测引物与探针组合，其特征在于：包括如下组分：
用于检测靶基因的探针为：5’-ATTTGTCGGAAGCCCAGTT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TAGTGAAGACTTACACAAGCC-’3；
用于扩增靶基因的下游引物为：5’-ATACCTAAAGTCATGAATCCTT-’3；
用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；
用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。


2.权利要求1所述引物与探针组合在制备细小病毒B19检测产品方面的应用。


3.一种细小病毒B19核酸定量检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物与探针组合。


4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。


5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为8pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为8pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。


6.根据权利要求3-5任一所述试剂盒，其特征在于：还包括B19V-PCR反应液、酶混合液、B19V定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；
所述B19V-PCR反应液包括权利要求1所述引物与探针组合和PCR缓冲液；
所述PCR缓冲液组成为30mol/LpH8.3Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓文奡，葛毅媛，谢龙旭，翁丹容，邱美兰，
申请(专利权)人：广东凯普生物科技股份有限公司，广州凯普医药科技有限公司，潮州凯普生物化学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44