【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因突变检测。更具体地，涉及一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物及其应用。
技术介绍
1、乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，hbv）简称乙肝病毒，是引发肝硬化、肝癌、肝衰竭等肝病的主要因素。针对乙肝病毒，临床常用替诺福韦酯（tenofovir disoproxfumarate，tdf）、替比夫定（telbivudine，ldt）、阿德福韦（adefovir dipivoxil，adv）、拉米夫定（lamivudine，lam）、恩曲他滨（emtricitabine，ftc）或恩替卡韦（entecavir，etv）等核苷（酸）类药物进行抗病毒治疗。核苷（酸）类药物虽具有药效快、副作用小的优点，但此类药物的作用靶点为hbv聚合酶/逆转录酶（reverse transcriptase，rt），长期使用会导致hbv基因组中编码聚合酶/逆转录酶的rt基因出现耐药突变，这也是众多慢性乙肝患者在长期服用核苷（酸）类药物后出现低病毒血症的主要原因。因此，在用药前或用药周期中定期检测hbv rt基因的耐药突变，不仅可以指导临床合理用药，还可以避免病情反弹，对整个抗病毒治疗过程具有重要意义。
2、目前，检测乙肝病毒基因耐药突变位点突变情况的方法主要有pcr产物直接测序法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（pcr-rflp）、反向膜杂交、固相基因芯片和实时荧光定量pcr等。其中，pcr产物直接测序法具有结果直观可靠、能够分析未知dna序列和突变位点、单向反应的读序能力较长且准确度高等优点，
3、为提高常规pcr-直接测序法检测hbv耐药基因突变情况的灵敏度，用巢氏pcr替代常规pcr，逐渐成为pcr产物直接测序法检测hbv基因耐药突变位点的首选方法。但传统巢氏pcr需利用两对pcr引物进行两轮pcr反应，存在操作繁琐、反应时间长且pcr产物易被污染的缺点。针对上述缺点，公开号为cn101698891a的中国专利中提供了一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法，其通过调整内外引物的浓度，在第一轮pcr反应完成之后加入第二轮pcr反应体系（即将第一轮pcr反应的产物全部作为第二轮pcr反应的模板，减少了将第一轮产物进行稀释的步骤），实现了单管两次反应的巢氏pcr检测。该方法虽一定程度上简化了传统巢氏pcr的步骤，但其反应过程中仍有一个开盖的步骤，并不能完全避免pcr产物被污染，不利于hbv基因耐药突变位点自动化检测仪器的开发。此外，该方法的检测灵敏度虽较高，hbv dna载量的检出限为100 iu/ml，但对于hbv dna载量＜100 iu/ml的样本，其检测成功率仅45.5%，无法完全满足临床检测需求。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术中存在的不足，提供了一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物和试剂盒。利用本专利技术所述引物或试剂盒，可成功扩增出hbv dna载量≥25 iu/ml的样本的耐药突变位点，从而可以结合pcr产物直接测序法检测所测样本的耐药突变情况，更好的指导临床合理用药。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物。
3、本专利技术的第二个目的是提供一种扩增乙肝病毒基因耐药突变位点的试剂盒。
4、本专利技术的第三个目的是提供所述单管巢氏pcr扩增引物或所述试剂盒在制备用于检测乙肝病毒基因耐核苷类药物突变情况的产品中的应用。
5、本专利技术的第四个目的是提供一种基于pcr产物直接测序法检测乙肝病毒基因耐核苷类药物突变情况的试剂盒。
6、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
7、本专利技术针对乙肝病毒rt基因第169、173、180、181、184、186、191、194、200、202、204、207、213、214、215、229、233、236、237、238、250、256位核苷酸位点，即乙肝病毒rt基因上会发生核苷（酸）类药物突变的位点，设计了单管巢氏pcr扩增引物，经反复的验证、筛选、调整、再验证等过程，获得了hbv dna载量检测限为25 iu/ml的单管巢氏pcr扩增引物和试剂盒。利用本专利技术所述引物或试剂盒，可成功扩增出hbv dna载量≥25 iu/ml的样本的耐药突变位点，可结合pcr产物直接测序法检测所测样本的耐药突变情况，更好的指导临床合理用药。
8、因此，本专利技术请求保护所述乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物，包括一对外引物和一对内引物；所述外引物中上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述内引物中上游引物的核苷酸序列如seqid no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、具体地，所述乙肝病毒基因为乙肝病毒rt基因，所述rt基因野生型在ncbi数据库中的登录号为：ku847633.1。
10、具体地，所述耐药为耐核苷（酸）类药物。
11、具体地，所述突变位点包括rt基因第169、173、180、181、184、186、191、194、200、202、204、207、213、214、215、229、233、236、237、238、250、256位核苷酸位点。
12、本专利技术还提供了一种扩增乙肝病毒基因耐药突变位点的试剂盒，所述试剂盒中含有本专利技术所述的单管巢氏pcr扩增引物。
13、具体地，所述试剂盒中还含有对照；包括阳性对照和/或阴性对照。
14、具体地，所述试剂盒中还含有巢氏pcr检测所需试剂。
15、具体地，所述试剂包括pcr buffer和dna聚合酶。
16、本专利技术还提供了一种利用所述单管巢氏pcr扩增引物或所述试剂盒扩增乙肝病毒基因耐药突变位点的方法，包括以下步骤：
17、s1.提取待测样本中的hbv dna；
18、s2.以提取所得hbv dna为模板进行pcr扩增；
19、s3.电泳检测pcr扩增所得产物。
20、作为其中的一种实施方式，步骤s2中pcr扩增所用反应体系为：10×pcr buffer 5μl、10 mm dntps mix 0.5～2 μl、5 u/μl dna聚合酶0.25～1 μl、10 μm的外引物各1.5～3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏PCR扩增引物，其特征在于，包括一对外引物和一对内引物；所述外引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述单管巢氏PCR扩增引物，其特征在于，所述乙肝病毒基因为乙肝病毒RT基因。
3.根据权利要求1所述单管巢氏PCR扩增引物，其特征在于，所述耐药为耐核苷类药物。
4.根据权利要求1所述单管巢氏PCR扩增引物，其特征在于，所述突变位点包括RT基因第169、173、180、181、184、186、191、194、200、202、204、207、213、214、215、229、233、236、237、238、250、256位核苷酸位点。
5.一种扩增乙肝病毒基因耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述单管巢氏PCR扩增引物。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有巢氏PCR检测所需试剂。
8. 根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包括PCR Buffer和DNA聚合酶。
9.权利要求1～4任一所述单管巢氏PCR扩增引物或权利要求5～8任一所述试剂盒在制备用于检测乙肝病毒基因耐核苷类药物突变情况的产品中的应用。
10.一种基于PCR产物直接测序法检测乙肝病毒基因耐核苷类药物突变情况的产品，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述单管巢氏PCR扩增引物或权利要求5～8任一所述试剂盒。
...【技术特征摘要】
1. 一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物，其特征在于，包括一对外引物和一对内引物；所述外引物中上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述内引物中上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
2.根据权利要求1所述单管巢氏pcr扩增引物，其特征在于，所述乙肝病毒基因为乙肝病毒rt基因。
3.根据权利要求1所述单管巢氏pcr扩增引物，其特征在于，所述耐药为耐核苷类药物。
4.根据权利要求1所述单管巢氏pcr扩增引物，其特征在于，所述突变位点包括rt基因第169、173、180、181、184、186、191、194、200、202、204、207、213、214、215、229、233、236、237、23...
【专利技术属性】
技术研发人员：方少彬，钟如燕，徐锋，殷乐，
申请(专利权)人：广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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