一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，属于PCR技术领域。本发明专利技术提供的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，包括引物、EasyTaq PCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；其中，所述引物包括针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。本发明专利技术所述的鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，可以同时快速、高效、准确的检测鳜鱼蛙病毒和弹状病毒，省时省力，为染病的鳜鱼争取更多的治疗时间，对于后续研究及防控具有重要意义。

A double PCR detection kit and method for mandarin fish frog virus and rhabdovirus

【技术实现步骤摘要】
一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法，属于PCR

技术介绍
鳜鱼为近年来水产养殖户们青睐的品种，其肉质鲜美，营养价值高，格外受群众欢迎。然而，鳜鱼蛙病毒(Sinipercachuatsiranairidovirus，SCRIV)和鳜鱼弹状病毒(Sinipercachuatsirhabdovirus,SCRV)是近年来引起鳜鱼发病的主要病毒性病原，是对鳜鱼养殖业危害极大的两种病毒，一旦感染发病，鳜鱼存活率极低，且没有有效的治疗方法，给养殖户们带来极大的经济损失。当前，在实验室检测SCRIV和SCRV病毒最常见的方法为聚合酶链式反应检测法。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)又被称为无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。聚合酶链式反应像是一种生物体外的特殊DNA复制，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高等特点。近年来的流行病学研究中发现存在SCRIV和SCRV混合的感染的现象，目前，实验室检测主要为分别进行SCRIV和SCRVPCR检测，需要进行两次PCR对不同的病毒进行检测，该方法费时费力。鳜鱼虹彩病毒和鳜鱼弹状病毒等病毒性疾病的高发，限制着鳜鱼养殖产业的发展，这两种病毒引起的疾病一旦发病一般没有有效的治疗方法，致死率高，而且鳜鱼更是常发生多种病毒混合感染的情况，给养殖中疾病的防控加大了难度，因此快速有效地诊断病原尤为关键，且尽早检出这两种病毒具有重要的现实意义。
技术实现思路
目前，鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)的防治方面没有特效药物，因此SCRIV和SCRV的早期监测和诊断显得尤为重要，然而常规的PCR检测方法单次只能检测一个病毒，需要大量的时间，操作也相当复杂，拖延了检测进度，进而错过最佳治疗时间。本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供同时快速、准确、高效的检测鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及检测方法。本专利技术所述的鳜鱼蛙病毒(SCRIV)及弹状病毒(SCRV)双重PCR检测试剂盒及检测方法一旦建立成功，一次PCR的时间下能检测两种病毒，省时省力，争取更多的治疗时间，对于后续研究及防控具有重要意义。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，包括引物、EasyTaqPCRSuperMix、阴性对照液和阳性对照液；其中，所述引物包括针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。作为本专利技术所述试剂盒的一种优选实施方式，所述针鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物为SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；所述针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物分别为SCRV-280-F/SCRV-280-R；其中，所述引物序列如下所示：SCRIV-400-F：AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGC；SEQIDNO：1；SCRIV-400-R：CCATGTCCCTGACTGAGCTGCTC；SEQIDNO：2；SCRV-280-F：GTGGCAGCAATTGACATGTTCTTC；SEQIDNO：3；SCRV-280-R：GATACTTTGGACAATCCCATGTC；SEQIDNO：4。作为本专利技术所述试剂盒的一种优选实施方式，所述EasyTaqPCRSuperMix为2×EasyTaqPCRSuperMix，所述阴性对照液为无菌ddH2O，所述阳性对照液为a和b；a：提取鳜鱼蛙病毒的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRIV作为阳性对照；b：以鳜鱼弹状病毒的cDNA为模板(提取鳜鱼弹状病毒的总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板)，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRV作为阳性对照；其中，所述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如下所示：SCRIV-MCP-F：ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTGGC；SEQIDNO：5；SCRIV-MCP-R：TTACAGGATGGGGAAACCCATG；SEQIDNO：6；SCRV-N-F：ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG；SEQIDNO：7；SCRV-N-R：TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC；SEQIDNO：8。作为本专利技术所述试剂盒的一种优选实施方式，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL、引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL或SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL、鳜鱼蛙病毒的DNA模板或鳜鱼弹状病毒的cDNA模板1μL、无菌ddH2O补充至25μL；作为本专利技术所述试剂盒的一种优选实施方式，所述PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃终延伸10min。作为本专利技术所述试剂盒的一种优选实施方式，所述回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接中，所述回收纯化的扩增产物的体积为4μL，所述pEASY-T1载体的体积为1μL；即将4μL回收纯化的扩增产物与1μLpEASY-T1载体连接。另外，本专利技术还提供采用所述试剂盒检测鳜鱼蛙病毒及弹状病毒的双重PCR方法，包括如下步骤：(1)待测样品DNA的提取；(2)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管内分别加入2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL，SCRIV-400-F/SCRIV-400-R和SCRV-280-F/SCRV-280-R混合的引物用量为1～6μL，P-SCRIV和P-SCRV混合的模板1μL，用无菌ddH2O补充至25μL；同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃～66℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min；(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的预期大小；(4)结果与判定：查看PCR产物是否能同时扩出鳜鱼蛙病毒400bp的MCP基因保守区和鳜鱼弹状病毒280bp的N基因保守区的片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物、EasyTaqPCR SuperMix、阴性对照液和阳性对照液；/n其中，所述引物包括针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物、EasyTaqPCRSuperMix、阴性对照液和阳性对照液；
其中，所述引物包括针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物，还包括针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼蛙病毒的MCP基因保守区设计的的引物为SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；所述针对鳜鱼弹状病毒的N基因保守区设计的引物为SCRV-280-F/SCRV-280-R；其中，所述引物序列如下所示：
SCRIV-400-F：AGTACACCATGCCAGAGGCCAAGC；SEQIDNO：1；
SCRIV-400-R：CCATGTCCCTGACTGAGCTGCTC；SEQIDNO：2；
SCRV-280-F：GTGGCAGCAATTGACATGTTCTTC；SEQIDNO：3；
SCRV-280-R：GATACTTTGGACAATCCCATGTC；SEQIDNO：4。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EasyTaqPCRSuperMix为2×EasyTaqPCRSuperMix，所述阴性对照液为无菌ddH2O，所述阳性对照液为a和b；
a：提取鳜鱼蛙病毒的DNA为模板，以SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRIV作为阳性对照；
b：以鳜鱼弹状病毒的cDNA为模板，以SCRV-N-F/SCRV-N-R为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物与pEASY-T1载体连接，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中培养获得质粒，构建重组质粒P-SCRV作为阳性对照；
其中，所述SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRV-N-F/SCRV-N-R引物序列如下所示：
SCRIV-MCP-F：ATGTCTTCTGTTACGGGTTCTGGC；SEQIDNO：5；
SCRIV-MCP-R：TTACAGGATGGGGAAACCCATG；SEQIDNO：6；
SCRV-N-F：ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG；SEQIDNO：7；
SCRV-N-R：TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC；SEQIDNO：8。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL、引物SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R各1μL或SCRV-N-F/SCRV-N-R各1μL、鳜鱼蛙病毒的DNA模板或鳜鱼弹状病毒的cDNA模板1μL、无菌ddH2O补充至...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁红茹，黄瑜聪，李宁求，林强，付小哲，刘礼辉，牛银杰，黄志斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44