提供一种诺如病毒的检测方法。本发明专利技术涉及利用逆转录‑聚合酶链式反应(reverse transcription‑polymerase chain reaction、RT‑PCR)检测诺如病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。更具体而言，涉及将待检体处理液和RT‑PCR反应液的混合液与待检体混合来检测诺如病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒，前述混合液还包含二甲基亚砜。
Detection of norovirus
【技术实现步骤摘要】
诺如病毒的检测方法
本专利技术涉及利用逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction、RT-PCR)检测诺如病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。更具体而言，将待检体处理液和RT-PCR反应液的混合液与待检体混合来检测诺如病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒，所述混合液还包含二甲基亚砜(dimethylsulfoxide、DMSO)。
技术介绍
诺如病毒是属于人杯状病毒(humancalicivirus)科的RNA病毒，基因组中具有约7000个碱基的单链RNA。该病毒是按照用电子显微镜观察到的形态学分类也被称为小圆形结构病毒(SmallRoundStructuredVirus,SRSV)、且以诺沃克样病毒(Norwalk-likevirus)这样的属名所称呼的病毒。属于诺如病毒的病毒被分类为基因组(genogroup)(GI)和基因组II(GII)这2种基因组，进而分别被分类为14和17或更多的基因型(genotype)。人感染诺如病毒时会引起呕吐、痢疾等急性胃肠炎症状。日本国内每年的食物中毒患者的约半数起因于诺如病毒，其中的约7成发生在11月～2月，诺如病毒作为冬季型的胃肠炎和食物中毒的原因病毒而已知。由诺如病毒导致的食物中毒主要由通过烹饪者的食品污染而产生。诺如病毒的感染性强、容易产生大规模的食物中毒等群体事件。对于人的感染途径主要是经口感染。感染者的粪便或呕吐物以及被它们直接或间接地污染的物品类、或者被诺如病毒污染的牡蛎或者其他的双壳贝类等食品类作为代表性的感染源而被列举。因此，鉴定诺如病毒感染患者、由该病毒导致的污染物对于防止病毒感染的扩大是重要的。作为用于检测由病毒导致的感染、污染的病毒检查，应用检测病毒抗原的免疫学的测定法、病毒基因扩增法(专利文献1～3、非专利文献1)。作为高灵敏度地检测诺如病毒的手段，可列举出用RT-PCR扩增诺如病毒的RNA、测定扩增产物量的方法。例如，根据厚生劳动省药品食品局食品安全部监视安全课的通知(非专利文献2和3)，广泛地利用RT-PCR法进行诺如病毒的检测以及利用实时PCR法进行诺如病毒的定量检测。RNA病毒粒子具有由RNA基因组与蛋白质形成的核被封入被称为衣壳的蛋白质壳中而成的基本结构。因此，为了利用基因扩增法检测病毒RNA，需要从病毒粒子中提取RNA。为了检测作为待检体的粪便中的诺如病毒，例如，将粪便待检体以5～10％(w/v)的浓度悬浮于蒸馏水或生理盐水中，由其离心上清，使用市售的病毒RNA提取试剂盒(例如，QIAamp(注册商标)ViralRNAMini、QIAGEN公司)提取/纯化RNA(非专利文献2)。然而，在多阶段的RNA提取·纯化操作之后进行RT-PCR的检测过程是复杂的。因此，提出了将粪便悬浮液与待检体处理液混合、进行短时间热处理来去除壳蛋白，使内部的RNA游离，将游离的RNA直接供于RT-PCR的简易的检测法(非专利文献4)。另一方面，为了对粪便悬浮液与待检体处理液的混合物进行热处理，需要做以下的工作：为了防止该混合物的暴沸、蒸发而用盖子对反应容器进行密闭，热处理之后卸下盖子，添加RT-PCR反应液。为了改善这一点，提出了将待检体与胍盐等离液剂混合，不必进行热处理而利用RT-PCR来检测病毒的方法(专利文献4)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2002/029119专利文献2：WO2002/029120专利文献3：日本特开2004-301684专利文献4：日本特开2017-209036非专利文献非专利文献1：KageyamaT,etal.BroadlyreactiveandhighlysensitiveassayforNorwalk-likevirusesbasedonreal-timequantitativereversetranscription-PCR.JClinMicrobiol.2003Apr；41(4):1548-57.非专利文献2：厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課食安監発第1105001号(平成15年11月5日)另附「ノロウイルスの検出法について」、最终订正：食安監発0514004号(平成19年5月14日)非专利文献3：厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課食安監発第1105001号(平成15年11月5日)另附「ノロウイルスの検出法について」、最终订正：食安監発1022第1号(平成25年10月22日)非专利文献4：NishimuraN,etal.DetectionofnorovirusesinfecalspecimensbydirectRT-PCRwithoutRNApurification.JVirolMethods.2010Feb；163(2):282-286.
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于，提供简便的诺如病毒的检测方法。具体而言，提供简便地检测诺如病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒，所述方法将待检体处理液和RT-PCR反应液的混合液与待检体混合，从而简便地检测诺如病毒，所述混合液还包含二甲基亚砜(dimethylsulfoxide、DMSO)。用于解决问题的方案本专利技术的目的通过以下的专利技术实现。〔1〕一种诺如病毒的检测方法，将待检体处理液和一步法RT-PCR反应液的混合液与待检体混合，通过RT-PCR反应来检测待检体中的诺如病毒，所述混合液还包含二甲基亚砜(DMSO)。〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，前述诺如病毒基因型为基因组I(GI)或基因组II(GII)。〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，前述待检体源自选自由生物试样、生物来源试样、环境试样和环境来源试样组成的组中的试样。〔4〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，前述待检体源自选自由排泄物试样、排泄物来源试样、呕吐物和呕吐物来源试样组成的组中的试样。〔5〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，前述待检体为将〔4〕所述的试样悬浮于水、生理盐水或缓冲液而得到的悬浮液。〔6〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，前述待检体为对〔5〕所述的悬浮液进行离心分离而得到的离心上清。〔7〕根据〔1〕～〔6〕中的任一项所述的方法，其中，前述待检体处理液为诺如病毒检测试剂盒(探针法)(岛津制作所、产品编号241-09325系列)所包含的样品处理试剂(SampleTreatmentReagent)，前述一步法RT-PCR反应液为前述试剂盒所包含的NoV试剂(NoVReagent)A、B和C的混合物、是包含逆转录酶和DNA聚合酶的反应液。〔8〕根据〔1〕～〔7〕中的任一项所述的方法，其中，前述待检体处理液与前述一步法RT-PCR反应液的混合比以体积比计为3：4～6。〔9〕根据〔1〕～〔8〕中的任一项所述的方法，其中，在前述待检体处本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诺如病毒的检测方法，将待检体处理液和一步法RT-PCR反应液的混合液与待检体混合，通过RT-PCR反应来检测待检体中的诺如病毒，所述混合液还包含二甲基亚砜(DMSO)。/n
【技术特征摘要】
20181130 JP 2018-2248951.一种诺如病毒的检测方法，将待检体处理液和一步法RT-PCR反应液的混合液与待检体混合，通过RT-PCR反应来检测待检体中的诺如病毒，所述混合液还包含二甲基亚砜(DMSO)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诺如病毒基因型为基因组I(GI)或基因组II(GII)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待检体源自选自由生物试样、生物来源试样、环境试样和环境来源试样组成的组中的试样。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待检体源自选自由排泄物试样、排泄物来源试样、呕吐物和呕吐物来源试样组成的组中的试样。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待检体为将权利要求4所述的试样悬浮于水、生理盐水或缓冲液中而得到的悬浮液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待检体为对权利要求5所述的悬浮液进行离心分离而得到的离心上清。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的方法，其中，所述待检体处理液为利用了探针法的诺如病毒检测试剂盒所包含的样品处理试剂(SampleTreatmentReagent)，所述一步法RT-PCR反应液为所述试剂盒所包含的NoV试剂(NoVReagent)A、B和C的混合物、是包含逆转录酶和DNA聚合酶的反应液，所述试剂盒为岛津制作所的产品编号241-09325系列试剂盒。
8.根据权利要求1～7中的任一项所述的方法，其中，所述待检体处理液与所述一步法RT-PCR反应液的...
【专利技术属性】
技术研发人员：小林慎一郎，四方正光，二宫健二，高冈直子，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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