鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光RPA的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种快速筛查检测新型冠状病毒(SARS‑CoV2)以及其他类SARS冠状病毒的三重RPA引物、探针、鉴定方法以及鉴定试剂盒。本发明专利技术在SARS‑CoV2病毒的N基因序列区域设计第一套引物、探针(标记为FAM)；在类SARS病毒保守区域E基因序列设计第二套引物、探针(标记为HEX)；在SARS‑CoV2病毒的S基因序列特异性区域设计第三套引物、探针(标记为Cy5，与其他类SARS病毒均不同)。相比目前WHO以及国家CDC推荐的新型冠状病毒确诊所用qPCR核酸检测方法，本发明专利技术具有敏感度高、快速以及有效区分新型冠状病毒和其他类SARS病毒的优点，可将病毒核酸检测时限从90min缩短到20min，可满足新型冠状病毒以及其他类SARS病毒的快速筛查需求。

Identification of novel coronavirus primers and application in three fluorescent RPA

【技术实现步骤摘要】
鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光RPA的应用
本专利技术属于应用生物
，具体涉及筛查鉴定新型冠状病毒以及其他类SARS冠状病毒的特异性快速筛查检测引物、探针、鉴定方法及鉴定试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV2)导致的肺炎疫情(COVID-19)目前席卷全球，其对经济、社会、人民正常的生活影响巨大，而对新冠病毒病例的快速诊断就成为切断传染源、控制疫情传播的重要手段。尤其是当前国内疫情趋于平稳，国外疫情严峻，输入性病例增加，对核酸排查的精准性要求更高。目前国家CDC和WHO均推荐了荧光定量PCR作为新型冠状病毒确诊方法，然而实际应用过程中时效性不是特别好，反转录荧光PCR耗时90min，还需要专门的荧光PCR仪进行数据分析。相比荧光定量PCR，荧光恒温RPA具有快速、准确、对仪器设备要求低等优势；此外，本专利技术三重RPA可用于鉴定区分新型冠状病毒与其他类SARS病毒，这对疫病防控及筛查其他类似疫病有重大影响。
技术实现思路
本专利技术提供了一组用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括第一套引物探针，所述第一套引物探针包括正向引物NF、反向引物NR和探针NP，所述引物和探针的序列如下：正向引物NF：AAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTC；反向引物NR：AGGTAGTAGAAATACCATCTTGGACTGAGATCT3’；探针NP：CACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGC/i6FAMdT/A/idSp//iBHQ1dT/ACCGAAGAGCTACCAG/iSpC3/。其中，探针NP的荧光标记为FAM。进一步的，上述一组用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针还包括第二套引物探针，所述第二套引物探针包括正向引物EF、反向引物ER和探针EP，所述引物和探针的序列如下：正向引物EF：GACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCT；反向引物ER：AGACTCACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCA；探针EP：TTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCA/iHEXdT/C/idSp//iBHQ1dT/TACTGCGCTTCGATTG/iSpC3/；其中，探针EP的荧光标记为HEX。进一步的，上述一组用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针还包括第三套引物探针，所述第三套引物探针包括正向引物SF、反向引物SR和探针SP，所述引物和探针的序列如下：正向引物SF：AACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACAT；反向引物SR：CCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAGCTGC；探针SP：TACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCT/iCy5dT/C/idSp//iBHQ2dT/CAGGTTGGACAGCTG/iSpC3/；其中，探针SP的荧光标记为Cy5。另一方面，本专利技术还提供了上述引物和探针在鉴定SARS-Cov2病毒以及非SARS-Cov2冠状病毒中的应用。进一步的，上述应用包括利用上述引物和探针对待测样本进行三重荧光RPA反应；如果探针NP、探针EP和探针SP均为阳性，判定为新型冠状病毒；如果探针EP为阳性，探针NP和探针SP为阴性，判定为非SARS-Cov2冠状病毒；如果探针NP、探针EP和探针SP均为阴性，判定为非冠状病毒。另一方面，本专利技术还提供了上述引物和探针在制备鉴定SARS-Cov2病毒以及非SARS-Cov2冠状病毒的试剂盒中的用途。进一步的，上述试剂盒为三重荧光RPA反应试剂盒。进一步的，可以根据反应结果判断待测样本的类型；具体而言，如果探针NP、探针EP和探针SP均为阳性，判定为新型冠状病毒；如果探针EP为阳性，探针NP和探针SP为阴性，判定为非SARS-Cov2冠状病毒；如果探针NP、探针EP和探针SP均为阴性，判定为非冠状病毒。进一步的，上述非SARS-Cov2冠状病毒包括SARS病毒、MERS病毒。另一方面，本专利技术还提供了一种能用于新型冠状病毒(SARS-Cov2)以及其他冠状病毒快速筛查检测的特异性三重荧光RPA试剂盒，上述试剂盒包括RNA提取试剂、以及上述引物和探针。本专利技术提供的鉴定新型冠状病毒(SARS-Cov2)的引物和探针，检测灵敏度低，通过一个三重荧光RPA反应即可区分鉴别新型冠状病毒、除SARS-Cov2病毒外的其他类SARS病毒，以及其他非相关病原，具有广泛的应用前景。附图说明图1、三重荧光RPA检测新型冠状病毒敏感度试验第一套引物探针，靶标N基因。从左至右，共7孔，分别是1：106copies/reaction(N基因)；2：105copies/reaction；3：104copies/reaction；4：103copies/reaction；5：102copies/reaction；6：101copies/reaction；7：Negativecontrol。图2、三重荧光RPA检测新型冠状病毒敏感度试验第二套引物探针，靶标E基因。从左至右，共7孔，分别是1：106copies/reaction(E基因)；2：105copies/reaction；3：104copies/reaction；4：103copies/reaction；5：102copies/reaction；6：101copies/reaction；7：Negativecontrol。图3、三重荧光RPA检测新型冠状病毒敏感度试验第三套引物探针，靶标S基因。从左至右，共7孔，分别是1：106copies/reaction(S基因)；2：105copies/reaction；3：104copies/reaction；4：103copies/reaction；5：102copies/reaction；6：101copies/reaction；7：Negativecontrol。图4、三重荧光RPA检测新型冠状病毒特异性试验。从左至右，共7孔，分别是1：PEDV病毒核酸；2：TGEV病毒核酸；3：PPRV病毒核酸；4：FMDV病毒核酸；5：RV病毒核酸；6：PPV病毒核酸；7：阴性对照；8：阳性对照(nCov-cDNA)。图5、三重荧光RPA检测模拟SARS病毒核酸。同时试验的还有三组，阳性对照、阴性对照，PEDV。仅展示模拟SARS病毒核酸检测结果，其他三组与图4结果类似，不再重复展示。图6、三重荧光RPA临床样本检测结果(FAM信号，N基因)。从左至右，共7孔，分别是1：临床样本2011；2：临床样本2012；3：临床样本2013；4：临床样本2014；5：临床样本2015；6：临床样本20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括第一套引物探针，所述第一套引物探针包括如下的正向引物NF、反向引物NR和探针NP：/n正向引物NF：/nAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTC；/n反向引物NR：/nAGGTAGTAGAAATACCATCTTGGACTGAGATCT3’；/n探针NP：/nCACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGC/i6FAMdT/A/idSp//iBHQ1dT/ACCGAAGAGCTACCAG/iSpC3/。/n

【技术特征摘要】
1.用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，所述的引物和探针包括第一套引物探针，所述第一套引物探针包括如下的正向引物NF、反向引物NR和探针NP：
正向引物NF：
AAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTC；
反向引物NR：
AGGTAGTAGAAATACCATCTTGGACTGAGATCT3’；
探针NP：
CACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGC/i6FAMdT/A/idSp//iBHQ1dT/ACCGAAGAGCTACCAG/iSpC3/。


2.根据权利要求1所述的用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，其特征在于，还包括第二套引物探针，所述第二套引物探针包括如下的正向引物EF、反向引物ER和探针EP：
正向引物EF：
GACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCT；
反向引物ER：
AGACTCACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCA；
探针EP：
TTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCA/iHEXdT/C/idSp//iBHQ1dT/TACTGCGCTTCGATTG/iSpC3/。


3.根据权利要求2所述的用于鉴定新型冠状病毒(SARS-CoV2)的引物和探针，其特征在于，还包括第三套引物探针，所述第三套引物探针包括如下的正向引物SF、反向引物SR和探针SP：
正向引...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕继洲，张舟，袁向芬，林祥梅，吴绍强，王彩霞，邓俊花，冯春燕，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11