一种检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒及方法。本发明专利技术设计筛选出的引物组合物包括2组特异性引物和探针，在本发明专利技术优选的反应体系和反应条件下，能够在同一反应管中同时鉴别检测猪蓝耳病和猪圆环病毒病，具有特异性好、灵敏度高、方便快捷等特点。

A primer composition, kit and method for detecting PRRSV and PCV

【技术实现步骤摘要】
一种检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒及方法
本申请涉及病毒检测
，具体而言，涉及一种检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒及方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸障碍综合症(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses，PRRSV)引起的一种猪急性传染病，俗称猪蓝耳病，病猪表现为食欲不振，体温升高，以耳根和腹部发红为明显特征，发病率和死亡率极高，该病对猪的危害性极大，引起极大的经济损失。猪圆环病毒病(porcinecircovirusdisease,PCVD))是由猪圆环病毒Ⅱ型(porcinecircovirus2,PCV-2)引起的一种猪传染病，病猪以早期淋巴结肿大，食欲不振，呼吸困难，腹泻，早产及死胎等为特征，发病率20％-60％和死亡率5％-35％。PRRSV和PCV-2引起的PRRS和PCVD是猪两种很常见的疫病，临床上还常常有PRRSV和PCV混合感染的报道，而且两种病引起猪的临床症状有时很相似，共同的症状表现为体温升高、急性死亡、怀孕母猪流产或死胎等，单靠临床诊断很难作出判断，需要借助实验室才能进行确诊。目前实验室诊断这两种病的方法常见的有病原分离鉴定、PCR方法、荧光定量PCR方法、ELISA方法、LAMP方法和GeXP方法等，但是这些方法都各有优点与缺点。病原分离鉴定耗时长、繁琐，PCR方法需要电泳才能得结果，ELISA方法检病原不够敏感，荧光定量PCR方法和GeXP方法需要昂贵的仪器设备，而单重LAMP方法也只能检一种病原体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测PRRSV和PCV的引物组合物，该引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括PCV-F3，PCV-B3，PCV-FIP，PCV-BIP，以及PCV-Probe，第二组特异性引物和探针包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示核苷酸序列，或为将序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；PCV-probe的5’端标记CY5.5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团，该CY5.5荧光基团在690nm波长下呈红色；PRRSV-probe的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520nm波长下呈绿色。本专利技术还提供了一种检测PRRSV和PCV的试剂盒,该试剂盒包括前述的引物组合物。进一步的，试剂盒中内引物(PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP、PCV-BIP)，外引物(PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3、PCV-F3)和探针Probe(PRRSV-Probe、PCV-Probe)的浓度比为80：10：1。进一步的，本专利技术试剂盒的每25ul反应体系中包括模板RNA/DNA2μL，2×缓冲液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U,内引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各40pmol，外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3和PCV-F3各5pmol，探针PRRSV-Probe和PCV-Probe各0.5pmol，加双蒸水补足至25μL；所述2×缓冲液成分为100mMKCl，200mMpH8.8的Tris–HCl，100mM(NH4)2SO4，80mMMgSO4，8Mbetaine，1％Tween-20，14mMdNTPs。本专利技术还提供一种检测PRRSV和PCV的方法，该方法采用前述的引物组合物或试剂盒进行环介导等温扩增反应。进一步的，环介导等温扩增反应的反应体系中内引物(PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP、PCV-BIP)，外引物(PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3、PCV-F3)和探针Probe(PRRSV-Probe、PCV-Probe)的浓度比为80：10：1。进一步的，环介导等温扩增反应反应体系每25ul反应体系中包括模板RNA/DNA2μL，2×缓冲液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U,内引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各40pmol，外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3和PCV-F3各5pmol，探针PRRSV-Probe和PCV-Probe各0.5pmol，加双蒸水补足至25μL；所述2×缓冲液成分为100mMKCl，200mMpH8.8的Tris–HCl，100mM(NH4)2SO4，80mMMgSO4，8Mbetaine，1％Tween-20，14mMdNTPs。进一步的，环介导等温扩增反应的反应过程包括62℃反应90分钟，85℃5分钟。本专利技术还提供一种前述的检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒及检测方法在同时检测猪蓝耳病和猪圆环病毒病中的应用。本专利技术的有益效果包括：采用本专利技术提供的检测PRRSV和PCV的引物组合物、试剂盒，检测特异性好，敏感性较高，方便快捷，在荧光下直接通过反应产物颜色判断结果，结果准确直观，可用于临床样品的检测，为临床快速检测区分PRRSV和PCV提供了多一种选择方法。本专利技术的二重LAMP，只需要2条外引物、2条内引物和1条带荧光基团的环引物，而单重常规LAMP则需要六条引物包括2条外引物、2条内引物和2条环引物。本专利技术的环引物上带有不同的发光荧光基团和淬灭基团，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，二重LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。结果通过不同的颜色一次能检测鉴别2种病原体，且快捷。本专利技术采用Bst3.0DNA聚合酶进行二重荧光LAMP扩增，与采用Bst2.0DNA聚合酶和BstDNA聚合酶大片段的二重荧光LAMP相比，具有更佳的的延伸能力活性、更强的逆转录活性以及强烈的链置换活性。以本专利技术的引物组及用该酶组建的检测试剂盒，一次加模板就能完成LAMP扩增，不需要预先对RNA模板单独进行逆转为cDNA，尤其是对DNA和RNA(或含有二级复杂结构的RNA)混合模板检测特别方便。对有二级复杂结构的RNA模板，采用Bst2.0DNA聚合酶或BstDNA聚合酶大片段进行二重荧光LAMP则无法进行扩增。附图说明图1为二重荧光LAMP特异性检测结果图，其中A为520nm荧光通道图,B为690nm荧光通道图,C为520nm和690nm荧光双通道图；图1A-1C中的1为PRRSVCH1R,2为PCV-2BH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测PRRSV和PCV的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括PCV-F3，PCV-B3，PCV-FIP，PCV-BIP，以及PCV-Probe，第二组特异性引物和探针包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，所述第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQ ID No.1至SEQID No.10所示核苷酸序列，或为将所述序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述PCV-probe的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在690nm波长下呈红色；所述PRRSV-probe的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520nm波长下呈绿色。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测PRRSV和PCV的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括PCV-F3，PCV-B3，PCV-FIP，PCV-BIP，以及PCV-Probe，第二组特异性引物和探针包括PRRSV-F3，PRRSV-B3，PRRSV-FIP，PRRSV-BIP，以及PRRSV-probe，所述第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示核苷酸序列，或为将所述序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述PCV-probe的5’端标记CY5.5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团，该CY5.5荧光基团在690nm波长下呈红色；所述PRRSV-probe的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520nm波长下呈绿色。


2.一种检测PRRSV和PCV的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。


3.根据权利要求2所述的检测PRRSV和PCV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中内引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP、PCV-BIP，外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3、PCV-F3和探针PRRSV-Probe、PCV-Probe的浓度比为80：10：1。


4.根据权利要求2或3所述的检测PRRSV和PCV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每25ul反应体系中包括模板RNA/DNA2μL，2×缓冲液12.5μL，Bst3.0DNA聚合酶320U,内引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各40pmol，外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3和PCV-F3各5pmol，探针PRRSV-Probe和PCV-Probe各0.5pmol，加双蒸水补...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，谢志勤，张民秀，范晴，罗思思，谢丽基，黄娇玲，王盛，曾婷婷，张艳芳，邓显文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45