猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法（荧光定量聚合酶链式反应，qPCR，又称real‑time PCR）。具体地，针对猪德尔塔冠状病毒、猪凸隆病毒、猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒，设计了四对特异性引物和TaqMan探针，实现了在一个PCR反应管中同时检测四种能够引起猪群腹泻的病毒，且其检测灵敏度达到初始模板浓度为每微升1×10

Detection of the pathogen of porcine viral diarrhea by quadruple TaqMan fluorescence quantitative PCR

【技术实现步骤摘要】
猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于病原体检测
，尤其涉及一种猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan探针法qPCR检测技术。
技术介绍
猪病毒性腹泻是造成我国养猪业经济损失的一个重要原因。造成猪病毒性腹泻的病原种类多样，并时常伴有混合感染，给相关检测、诊断、防治工作带来了很大困扰。为了更好地监测和控制猪病毒性腹泻，对于猪群中包括猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)、猪凸隆病毒(PorcineTorovirus，PToV)、猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SwineAcuteDiarrheaSyndromeCoronavirus,SADS-CoV)在内的多种高致病性、高传染性的猪病毒性腹泻病病原的检测显得十分必要。因此，针对猪病毒性腹泻病病原建立一种简便、快速、高效、经济的检测方法是兽医临床实践中亟需解决的问题。四重qPCR检测技术可以最多同时检测出四种猪病毒性腹泻病病原，相比于普通PCR具有灵敏度高、精确度好、无需电泳便可直接分析结果等优点，极大地缩短了检测过程中的物料成本和检测人员的时间成本，尤其适用于大规模的样品检测和样品的混合感染检测。但是，由于四重qPCR在一个体系中同时存在多对引物及探针，为了保证其有效进行，各引物对和探针之间就必须要保持高度的特异性以避免出现非特异性的扩增产物和荧光信号，并且还必须要保持相对一致的扩增效率便于对模板量进行测算。另外，模板中更为复杂的核酸环境，不同引物对所要求的不同的退火温度也都是制约多重qPCR检测方法建立的主要因素。qPCR相较于传统PCR具有极高的灵敏度，而且能够允许多个通道同时检测多种不同的病原，使得建立多重qPCR检测方法更有意义。所以，建立一种四重TaqMan探针法qPCR检测方法虽然实现起来颇具难度，但具有很高的临床生产价值。
技术实现思路
解决的技术问题：为了解决多重PCR技术在应用于猪群的病毒性腹泻疾病诊断中效果不佳等技术问题，本专利技术提出了一种猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan探针法qPCR检测方法。技术方案：猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：步骤1，设计四种病毒的特异性qPCR检测引物对序列及TaqMan探针序列：用于检测猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus,PDCoV)的引物对序列及TaqMan探针序列：上游引物PD-Detection(F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’(SEQIDNO.1)下游引物PD-Detection(R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’(SEQIDNO.2)TaqMan探针PD-Probe：5’-TexasRed-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’(SEQIDNO.3)用于检测猪凸隆病毒(PorcineTorovirus,PToV)的引物对序列及TaqMan探针序列：上游引物PT-Detection(F)：5’-TCATCCACCCAGTTCAAAT-3’(SEQIDNO.4)下游引物PT-Detection：5’-TGCACAATTCTCTCTCCAAAT-3’(SEQIDNO.5)TaqMan探针PT-Probe：5’-VIC-CCTCAGaTTTCGaAGATAGaACC-BHQ1-3’(a：LNC，锁核酸)(SEQIDNO.6)用于检测猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV)的引物对序列及TaqMan探针序列：上游引物PE-Detection(F)：5’-CTCCCTTGAATTTGAGTTCG-3’(SEQIDNO.7)下游引物PE-Detection(R)：5’-ACCACCTGTAACCTTGATAC-3’(SEQIDNO.8)TaqMan探针PE-Probe：5’-FAM-TTACCAACAGCCTTATTAAGCAC-MGB-3’(SEQIDNO.9)用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SwineAcuteDiarrheaSyndromeCoronavirus,SADS-CoV)的引物对序列及TaqMan探针序列：上游引物SA-Detection(F)：5’-CATTTGCCGTTCTTGACCAT-3’(SEQIDNO.10)下游引物SA-Detection(R)：5’-AACCCAGCAATTGTTATCTGAA-3’(SEQIDNO.11)TaqMan探针SA-Probe：5’-Cy5-CAAGTGCACGCTTACCATCAACTACT-BHQ3-3’(SEQIDNO.12)；步骤2，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；步骤3，使用qPCR引物和TaqMan探针进行检测：以步骤2获得的cDNA作为模板，采用步骤1的qPCR检测引物及TaqMan探针进行qPCR扩增，并收集荧光信号；步骤4，根据步骤3收集得到的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PDCoV、PToV、PEDV、SADS-CoV，当Cq值大于35的结果判断为阴性。进一步地，步骤2中反转录使用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))进行，其反应总体系为20μL，包括：1μLRandomHexamerPrimer、1μLOligo(dT)18Primer、5μLnuclease-freeWater、5μL总RNA，混匀后65℃孵育5min，冰浴3min，继续加入：4μL5×ReactionBuffer、2μL10×dNTP预混液、1μLRevertAidM-MuLVReversetranscriptase(RT)和1μLRiboLockRNaseInhibitor(RI)。进一步地，步骤2中反转录的反应程序为：25℃5min，42℃60min，70℃5min，反应后得到cDNA模板。进一步地，步骤3中PCR扩增的反应体系为：10μL2×AceQqPCRProbeMasterMix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，初始浓度为10μM的PD-Detection(F)、PD-Detection(R)、PT-Detection(F)、PT-Detection(R)、PE-Detection(F)、PE-Detection(R)、SA-Detection(F)、SA-Detection(R)引物各0.6μL，初始浓度为10μM的PD-Probe、PT-Probe、PE-Probe、SA-Probe探针各0.1μL，cDNA模板与ddH2O体积和为4.8μL，体系总体积为20μL。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1，设计四种病毒的特异性qPCR检测引物对序列及TaqMan探针序列：/n用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：/n上游引物PD - Detection (F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’，/n下游引物PD - Detection (R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’，/nTaqMan探针PD - Probe：5’-Texas Red-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’；/n用于检测猪凸隆病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：/n上游引物PT - Detection (F)：5’-TCATCCACCCAGTTCAAAT-3’，/n下游引物PT - Detection：5’-TGCACAATTCTCTCTCCAAAT-3’，/nTaqMan探针PT - Probe：5’-VIC- CCTCAG

【技术特征摘要】
1.猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，设计四种病毒的特异性qPCR检测引物对序列及TaqMan探针序列：
用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PD-Detection(F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’，
下游引物PD-Detection(R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’，
TaqMan探针PD-Probe：5’-TexasRed-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’；
用于检测猪凸隆病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PT-Detection(F)：5’-TCATCCACCCAGTTCAAAT-3’，
下游引物PT-Detection：5’-TGCACAATTCTCTCTCCAAAT-3’，
TaqMan探针PT-Probe：5’-VIC-CCTCAGaTTTCGaAGATAGaACC-BHQ1-3’（a：LNC，锁核酸）；
用于检测猪流行性腹泻病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PE-Detection(F)：5’-CTCCCTTGAATTTGAGTTCG-3’，
下游引物PE-Detection(R)：5’-ACCACCTGTAACCTTGATAC-3’，
TaqMan探针PE-Probe：5’-FAM-TTACCAACAGCCTTATTAAGCAC-MGB-3’；
用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物SA-Detection(F)：5’-CATTTGCCGTTCTTGACCAT-3’，
下游引物SA-Detection(R)：5’-AACCCAGCAATTGTTATCTGAA-3’，
TaqMan探针SA-Probe：5’-Cy5-CAAGTGCACGCTTACCATCAACTACT-BHQ3-3’；
步骤2，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；
步骤3，使用qPCR引物和TaqMan探针进行检测：以步骤2获得的cDNA作为模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：粟硕，潘中洲，陆佳萱，张骋，赵雯，何婉婷，王茹怡，翟晓凤，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32