一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法技术

一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，是将含囊泡病毒的待测样品超声破碎，然后稀释、过滤，用其感染对数生长期细胞1h，收集细胞悬液、计算细胞数量，提取总DNA；对上述DNA进行qPCR检测，以含有该片段的pGEM‑T载体为标准品，绘制绝对定量PCR检测的标准曲线。根据样品的Ct值计算出每样品中含有的病毒基因组拷贝数。根据感染复数公式，计算感染每个细胞的平均病毒粒子数量，即感染时病毒与细胞数量的比值计算病毒滴度。本方法测定囊泡病毒滴度，当样品浓度为1×10

An absolute quantitative PCR method for rapid detection of vesicular virus titer

【技术实现步骤摘要】
一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法。
技术介绍
囊泡病毒(ascoviruses)是囊泡病毒科(Ascoviridae)所有毒株的统称，其基因组为环状双链DNA，大小在100-200kb之间。囊泡病毒口服感染率极低，主要依靠寄生蜂携带在鳞翅目幼虫个体间传播。囊泡病毒侵染宿主幼虫后宿主幼虫表现为生长发育迟缓、肌肉弹性降低、取食量减少等症状，宿主幼虫感染后期，包含病毒粒子的囊泡被释放到血淋巴中，宿主幼虫血淋巴由无色透明变成乳白色，形成囊泡病毒感染的典型症状。囊泡病毒对宿主细胞的感染过程，始于细胞核的急剧增大，随着核膜凹陷，细胞增大至健康细胞的5-10倍，细胞膜、质膜等内陷部分逐渐相互连接，将原宿主细胞割裂形成20-30个封闭的小室，成熟的病毒粒子被包含在这些小室中，最后变成包含有病毒粒子的囊泡，也称病毒囊泡。由于囊泡病毒特殊的细胞病理学特征，迄今未有较为理想的囊泡病毒滴度测定方法，严重影响了囊泡病毒及相关学科的研究进程。目前测定病毒滴度的方法主要有蚀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，该方法步骤如下：/n1)病毒的收集及样品的处理：收集感染囊泡病毒的待测样品，超声破碎，稀释后过滤；/n2)细胞感染及计数：将昆虫细胞接种于6孔板中，加入步骤1)得到的囊泡病毒稀释液，恒温箱培养，收集囊泡病毒细胞，计数；/n3)病毒基因组拷贝数的计算：以步骤2)收集到的细胞提取基因组DNA，以提取的DNA为模板进行绝对定量PCR检测；以含有该DNA片段的pGEM-T载体为标准品，绘制绝对定量PCR检测的标准曲线；对待测样品进行qPCR检测，根据所产生的Ct值基于该标准曲线计算样品中含有的病毒基因组拷贝数；/n4)囊泡病毒滴度计算：基于...

【技术特征摘要】
1.一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，该方法步骤如下：
1)病毒的收集及样品的处理：收集感染囊泡病毒的待测样品，超声破碎，稀释后过滤；
2)细胞感染及计数：将昆虫细胞接种于6孔板中，加入步骤1)得到的囊泡病毒稀释液，恒温箱培养，收集囊泡病毒细胞，计数；
3)病毒基因组拷贝数的计算：以步骤2)收集到的细胞提取基因组DNA，以提取的DNA为模板进行绝对定量PCR检测；以含有该DNA片段的pGEM-T载体为标准品，绘制绝对定量PCR检测的标准曲线；对待测样品进行qPCR检测，根据所产生的Ct值基于该标准曲线计算样品中含有的病毒基因组拷贝数；
4)囊泡病毒滴度计算：基于步骤3)得到的病毒基因组拷贝数及步骤2)的病毒细胞数量，计算样品中的囊泡病毒滴度。


2.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述囊泡病毒为HvAV、SfAV、TnAV或DpTV。


3.如权利要求2所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3)中绝对定量PCR检测所用引物是对应所述病毒设计的。


4.如权利要求3所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法，其特征在于，所述囊泡病毒HvAV的引物序列如下：
AV-F：ATGAAAGCCGTGCTTAACGT，
AV-R：CTAGCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国华，宋晓慧，李梓琦，黎妮，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43