一种用于进行病毒包装效率检测的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测病毒包装效率的方法，该方法基于病毒成功包装核酸后表面电荷会发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。

A method for detecting the efficiency of virus packaging

【技术实现步骤摘要】
一种用于进行病毒包装效率检测的方法
本专利技术涉及一种新型的病毒包装效率检测方法，特别是在转基因与基因治疗领域中，用于判断病毒包装外源基因的包装效率。
技术介绍
基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。相比传统医疗手段，以基因技术为基础的基因治疗手段更具针对性，能够获得较为理想的治疗效果，并能大大减轻患者痛苦，其应用被业内普遍看好。自2012年开始，全球新增基因治疗临床试验754例。其中最引人注目的领域当属利用CAR-T细胞靶向肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤的免疫治疗(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫治疗)。2013年CAR-T治疗被《科学》(Science)杂志评选为“十大科技进展”之首。CAR-T技术现阶段主要用于血液肿瘤的治疗，主要代表是FDA于2017年批准的Kymriah(诺华)和Yescarta(Kite)两款产品。基因治疗的流程一般是利用基因工程的方法将正常基因插入到病毒载体的DNA上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3)把重组后的病毒直接注入病人体内，病毒感染病变细胞并将正常基因带到靶细胞中，实现疾病的治疗；或者(1)将正常基因插入到病毒载体的DNA上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3)获取病人的体细胞，如造血干细胞等，体外培养扩增；(4)用重组后的病毒感染获取的病人细胞，病毒把正常基因导入靶细胞中；(5)对携带正常基因的重组细胞体外培养扩增；(6)将携带正常基因的重组细胞回输到病人体内，实现疾病的治疗。以上无论哪种方法都会用到载体，目前使用的主要载体包括真核载体和病毒载体等，其中病毒载体的研究更加热门，较常用的病毒载体包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可装载DNA片段容量高达5kb，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。腺病毒(adenovirus)颗粒没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。逆转录病毒，球形，有包膜，80～120nm，含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科中的亚科，逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。在使用病毒包装核酸的时候，并不是所有的病毒都正确完成了包装，往往存在损伤的、无感染能力的病毒，这些“无效”病毒会影响后续的应用，因此病毒包装效率的测定非常重要。在现有的检测体系中，传统的包装效率检测的方法有空斑检测法、稀释荧光计数法、定量PCR法、ELISA法(检测P24蛋白含量)等，其中空斑检测法为金标准，但是这些方法或者费时费力，或者成本高，无法实时反应病毒包装过程中的情况，严重影响了病毒的生产制造工艺的效率。因此，亟需一种可以简单精确的用于病毒包装效率检测的方法。ZETA电位(Zetapotential)又叫电动电位或电动电势(ζ-电位或ζ-电势)。Zeta电位的主要用途之一就是检测颗粒表面的电荷数量。例如病毒颗粒表面是带电荷的，其在一定的溶液体系中会形成一定的ZETA电位，当病毒表面的电荷发生变化后，其ZETA电位会发生改变。而病毒包装的核酸是带有负电荷的，因此当病毒完整的包装了核酸后，其表面电荷受其影响发生改变，导致ZETA电位的变化，因此测定病毒颗粒表面ZETA电位的变化可有效分辨病毒包装的完整性。ZETA电位的测定可以基于TRPS技术(Tunableresistivepulsesensing，可调电阻脉冲传感技术)，悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。当病毒颗粒通过电解液体系时，由于病毒表面带有电荷，当通过改变电压调节电场的强度时，病毒颗粒通过电场的速率会发生变化，将这种变化与已知ZETA电位与大小的粒子进行比较时，即可测定病毒颗粒的ZETA电位和大小。TRPS检测的结果可以使用散点图的形式进行展示，其中横坐标为颗粒大小(nm级别)，纵坐标为ZETA电位。完整包装的病毒颗粒与未包装核酸的病毒颗粒其大小基本一致，对应在横坐标的大致相同区域；而带电荷的差异导致两种病毒颗粒ZETA电势的不同，对应在纵坐标的不同区域。而这种基于TRPS技术的检测需要的样本体积大约为30ul，检测时间为2min，相较于传统病毒包装效率检测技术效率大大提高。因此，TRPS技术是一种可用于进行病毒核酸包装效率检测的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测病毒包装效率的方法，该方法基于病毒成功包装核酸后表面电荷会发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。为实现以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：采用常规方法进行细胞培养，当细胞生长至70-80％饱和度时，将组成慢病毒载体的3个质粒进行转染，转染6-8小时后换完全培养液，再培养约48-60小时后，收集病毒培养上清液，经离心后，病毒沉淀加入提前过滤的PBS重悬。将病毒重悬液使用表面电荷测定仪器进行检测，对检测到的病毒携带的电荷进行分析，根据电荷差异判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算得到病毒颗粒包装效率。附图说明图1是通过qNano仪器检测的500个病毒颗粒分布图。图2是500个病毒颗粒表面电荷情况图。具体实施方式实施例1病毒制备按照常规方法培养293T细胞，当细胞长至70-80％饱和度时，将组成慢病毒载体的3个质粒(含eGFP基因)进行转染，转染6-8小时后换完全培养液，再培养约48-60小时后，收集病毒培养上清液，经离心后，病毒沉淀加入提前过滤的PBS重悬。实施例2Real-timePCR检测病毒颗粒数量取2μL病毒悬液进行DNase处理，处理后的混合液，加入蛋白酶K等处理，酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀，DEPC水溶解。应用实时定量PCR测定病毒LTR拷贝数，软件分析荧光检测数据。表1.PCR引物与探针引物和探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于病毒包装效率检测的方法，其特征在于该方法基于病毒成功包装核酸后，由于核酸带有电荷，会导致病毒表面带有的电荷发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于病毒包装效率检测的方法，其特征在于该方法基于病毒成功包装核酸后，由于核酸带有电荷，会导致病毒表面带有的电荷发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。


2.根据权利要求1所述，由于核酸带有电荷的不同，病毒成功包装核酸后表面电荷的变化既包括表面电荷的增加也包括由于表面电荷的减少。


3.根据权利要求1所述，通过电荷检测仪器检测单位数量的病毒颗粒表面电荷，其表面电荷使用符号Z表示，Zi...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋凯，张庆华，王世东，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：上海华盈生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31