一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，该方法包括如下步骤：将血清样品离心得到的上清液；加入富集试剂组得到复合物；加入抽提试剂组得到相应的组成物质，所述组成物质包括蛋白和RNA，所述蛋白包括NSE和CEA，所述RNA包括miR

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂。

技术介绍

[0002]肺癌是中国发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。早期肺癌表现隐匿且多样化，临床特征及体征不明显，大部分肺癌患者发现时已经处于晚期。肺癌晚期的5年生存率极低，而肺癌早期(Ⅰ期)的五年生存率可以高达50％以上。由此，肺癌的早期发现诊断是降低肺癌发病率和死亡率的关键环节。
[0003]目前临床上有多种用于肺癌的检测手段，如CT、X线胸片、脱落细胞学检查和经CT定位穿刺活检等。虽然LDCT在一些地区进行的筛查研究取得了一定的研究进展，但符合LDCT的高危人群筛查标准的患者少，筛查准确度不够高等。
[0004]外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30
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150nm的具有脂质双层膜的微小囊泡，广泛存在于各种体液中，如血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁和腹水等，同时也来源于体内红细胞、白细胞、巨噬细胞和上皮细胞等多种细胞。外泌体含有母细胞来源的蛋白质、rRNA、miRNA以及DNA等，在生理和疾病状态下介导细胞间的信号转导，具有疾病诊断、免疫调节等作用。肺来源的外泌体介导的细胞间相互作用可能在肺癌的发生转移过程中发挥重要的作用，而循环血液中肺来源外泌体的肺癌特异性蛋白和RNA可以成为肺癌诊断的理想生物标志物，这将对肺癌的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。
[0005]以血清肺来源外泌体为例的液体诊断具有以下优点：1、创伤小，病人依从性好；2、收集方便，利于存储；3、简单方便易操作。但是从血清中直接抽提肺来源蛋白、RNA难度较大。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，该试剂组提供的各个试剂组分之间协调配合，使用后可完整的将外泌体中的蛋白和RNA提取出来。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供上述复合试剂的使用方法，该方法步骤简单，可完整的提取出肺来源外泌体的蛋白和RNA，解决现有技术中难以提取肺来源蛋白、RNA的问题。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术特采用以下技术方案：
[0010]本专利技术提供了一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，该复合试剂包括富集试剂组、抽提试剂组；
[0011]所述富集试剂组包括富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3，所述富集试剂1按重量份计，包括10
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20份浓度为25％的PEG20000、5
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15份浓度为20％的PEG10000、1
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4份浓度为0.05％的吐温20、1
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4份磷酸二氢钾溶液、1
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4份磷酸氢二钠溶液、1
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4份氯化钠溶液和1
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4份
氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括5
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15份浓度为20％的PEG20000、5
‑
15份浓度为20％的PEG8000、5
‑
15份葡萄糖溶液和2
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8份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括0.1
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5份包被SFTPC抗体的Protein A/G磁珠；
[0012]所述抽提试剂组包括蛋白抽提试剂组和RNA抽提试剂组；
[0013]所述蛋白抽提试剂组包括RIPA强裂解液；
[0014]所述RNA抽提试剂组包括RNA抽提试剂1、RNA抽提试剂2和RNA抽提试剂3、RNA清洗缓冲液1和RNA清洗缓冲液2，所述RNA抽提试剂1包括Trizol裂解液，所述RNA抽提试剂2包括浓度为100％的三氯甲烷，所述RNA抽提试剂3包括浓度为100％的乙醇，所述RNA清洗缓冲液1为3份RWP缓冲液，所述RNA清洗缓冲液2为2份RPE缓冲液。
[0015]其中，各个试剂的用途如下所示：
[0016]25％的PEG20000：用于富集外泌体；
[0017]20％的PEG10000：用于富集外泌体；
[0018]0.05％的吐温：用于稳定缓冲液体系，便于后续洗涤；
[0019]磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钠溶液、氯化钠溶液和氯化钾溶液：缓冲液成分；
[0020]20％的PEG20000：用于富集外泌体；
[0021]20％的PEG8000：用于富集外泌体；
[0022]葡萄糖溶液：用于协助富集外泌体；
[0023]乙酸钠溶液：用于中和外泌体表面的阴性负离子，促进外泌体聚集沉降；
[0024]包被SFTPC抗体的Protein A/G磁珠：用于富集肺来源外泌体。
[0025]其中，PEG可用于外泌体富集实验，不同分子量且不同浓度的PEG溶液与葡萄糖等配合使用可以增加外泌体富集效果，收集得到更多的外泌体，分离效率远超单一的PEG。此外，乙酸钠溶液、吐温等试剂的联合应用也增加了外泌体的分散性和稳定性，去杂质效果更好，大大地提高了外泌体的提取效率和纯度。
[0026]同时，采用的富集试剂组，一步步的进行外泌体的优化选择，通过富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3一步步的去除由大到小分布的杂质，保证了富集的外泌体的纯度，而且本专利技术所公布的各个试剂之间的比例也是极为重要的，所使用的缓冲的试剂量也是需要控制的，通过本专利技术的大量的实验证明，在缓冲试剂的使用量过大时，会造成外泌体的破损，在使用的缓冲试剂的量过小时，则会导致外泌体之间发生聚集的现象，而且所富集的外泌体有明显的杂质，无法保证收集的外泌体的纯度，这也就说明了本专利技术的各个试剂的使用的比例也是尤其重要的，是经过多次的实验得到的最佳的比例。
[0027]对于本专利技术的富集试剂组，之所以需要采用三种富集试剂，是因为通过实践发现如何只采用富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3中的任意一种，不进行组合使用，无法保证富集的外泌体的纯度，而且单一的富集试剂其配合作用较弱，无法保证在外泌体富集过程中的质量，容易发生破损也会出现外泌体聚集的现象，然而当将三种富集试剂配合后不仅保证了外泌体的质量，也能保证得到的外泌体的纯度，因此上述组合是最优的方案。
[0028]同样地，对于富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3本身的组成，无论是所选择的组分还是各个组分的用量也是为了保证富集后的外泌体能够达到所要求的纯度，且在富集过程中外泌体不容易破损所服务的，比如所添加的吐温、葡萄糖等物质一方面是为了提高外泌体的分散性不容易聚集，还能够增加外泌体的稳定性更容易被聚集，但是其加量不宜过
大，否则其外泌体富集的纯度无法保证，也会因引入过多的试剂而影响富集操作的正常进行。
[0029]可见，对于本专利技术的方案来说无论是富集试剂的种类、个数，还是富集试剂本身所包含的组分以及用量，均是经过一系列的创造性实践才最终确定的，并不是通过简单的操作实践就可以得到的，是需要付出的大量创造性劳动的。
[0030]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，其特征在于，包括富集试剂组、抽提试剂组；所述富集试剂组包括富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3，所述富集试剂1按重量份计，包括10
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20份浓度为25％的PEG20000、5
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15份浓度为20％的PEG10000、1
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4份浓度为0.05％的吐温20、1
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4份磷酸二氢钾溶液、1
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4份磷酸氢二钠溶液、1
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4份氯化钠溶液和1
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4份氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括5
‑
15份浓度为20％的PEG20000、5
‑
15份浓度为20％的PEG8000、5
‑
15份葡萄糖溶液和2
‑
8份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括0.1
‑
5份包被SFTPC抗体的Protein A/G磁珠；所述抽提试剂组包括蛋白抽提试剂组和RNA抽提试剂组；所述蛋白抽提试剂组包括RIPA强裂解液；所述RNA抽提试剂组包括RNA抽提试剂1、RNA抽提试剂2和RNA抽提试剂3，所述RNA抽提试剂1包括Trizol裂解液，所述RNA抽提试剂2包括浓度为100％的三氯甲烷，所述RNA抽提试剂3包括浓度为100％的乙醇。2.根据权利要求1所述的复合试剂，其特征在于，所述富集试剂1按重量份计，包括13
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18份浓度为25％的PEG20000、8
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12份浓度为20％的PEG10000、1.5
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3份浓度为0.05％的吐温20、1.5
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3份磷酸二氢钾溶液、1.5
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3份磷酸氢二钠溶液、1.5
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3份氯化钠溶液和1.5
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3份氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括8
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12份浓度为20％的PEG20000、8
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12份浓度为20％的PEG8000、8
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12份葡萄糖溶液和3
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7份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括0.5
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4份包被SFTPC抗体的Protein A/G磁珠。3.根据权利要求1所述的复合试剂，其特征在于，所述富集试剂1按重量份计，包括15份浓度为25％的PEG20000、10份浓度为20％的PEG10000、2份浓度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆华，宋凯，匡鑫，
申请(专利权)人：上海华盈生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：