一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3D类器官培养的方法技术

本发明专利技术属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。本发明专利技术首次在鸭肠道领域提出3D类器官培养，并通过调整消化液的配比与浓度、水平摇床低温消化的时间与次数，优化鸭小肠隐窝干细胞的分离技术，使获得的鸭小肠隐窝干细胞形态更加完整，存活率与出芽率更高。本发明专利技术优化了用于培养鸭小肠隐窝干细胞的培养基的配方，使鸭小肠隐窝干细胞能更好的分化形成3D类器官。本发明专利技术确定了鸭小肠隐窝干细胞的分离条件与最佳培养方法，为后续利用鸭小肠3D类器官研究肠道隐窝干细胞功能奠定了良好的基础。官研究肠道隐窝干细胞功能奠定了良好的基础。官研究肠道隐窝干细胞功能奠定了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3D类器官培养的方法


[0001]本专利技术属于动物组织分离和培养
具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。

技术介绍

[0002]随着人类对生命科学研究的不断深入，模型系统已经成为相关研究的重要工具。传统用于肠道生理病理研究的模型是由某单一种类细胞构成的，而肠道各部分具有独特生理功能与组织结构，传统单细胞模型无法做到真实模拟肠道的结构、形态及功能的作用，严重限制了肠道健康功能调控的研究。近年来，肠道3D类器官的发展为肠道健康研究提供了一个新的模型。类器官(organoids)来源于干细胞或器官祖细胞，是利用干细胞增殖分化的特性进行体外3D培养后形成的细胞团。类器官与来源器官的关系紧密，具有来源器官的三维细胞结构，可重现来源器官的部分功能与空间构架，可真实的反应肠道内的生理和病理过程。
[0003]目前人和小鼠的肠道3D类器官模型的研究已经比较成熟，人们能够在体外稳定传代培养人和小鼠的肠道3D类器官，且能长期冻存和复苏，已被广泛应用。
[0004]肠道是机体消化吸收营养物质的主要器官，也是防止肠道微生物侵袭的先天屏障，肠道健康对机体至关重要。鸭肠道损伤会导致生产力下降、抗病力差甚至死亡，给养殖户带来严重的经济损失，目前人们主要利用传统的2D单细胞培养来进行鸭肠道损伤的相关研究，但由于2D培养的种种缺点，很难真实的反映鸭肠道内的生理与病理情况。类器官培养是一种新型的3D模型，可真实反映肠道内的病理与生理情况，但目前有关鸭肠道类器官培养的相关文章却鲜见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于建立稳定的鸭小肠隐窝干细胞的分离鉴定方法和鸭小肠3D类器官模型培养方法。本专利技术通过参考小鼠、猪、鸡等动物的肠道隐窝干细胞分离和3D类器官培养方法，建立了稳定的鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养技术。
[0006]为达到上述技术目的，本专利技术具体技术方案如下：
[0007]首先，本专利技术提供一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，包括以下步骤：
[0008](1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；
[0009](2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；
[0010](3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；
[0011](4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。
[0012]具体的，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。
[0013]具体的，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。
[0014]具体的，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。
[0015]其次，本专利技术提供一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，包括以下步骤：
[0016](a)将上述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；
[0017](b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；
[0018](c)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；
[0019](d)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；
[0020](e)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
[0021](f)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5
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8min，用PBS洗涤3次，每次3min；
[0022](g)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
[0023](h)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。
[0024]最后，本专利技术还提供一种鸭小肠3D类器官培养的方法，制备类器官生长培养基和类器官分化培养基，将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液计数后，去上清重悬隐窝干细胞铺于24孔板中，依次加入类器官生长培养基和更换类器官分化培养基。
[0025]具体的，所述类器官生长培养基，其配方为：Wnt3a 40μl；R
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spondin1 40μl；Noggin 40μl；B27 supplement 800μl；N2 supplement 400μl；n
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Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；SB202190 40μl；Y27632 40μl；Nicotinamide 400μl；GastrinⅠ20μl；A83
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01 80μl；DMEM
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F12 37.98ml，共40ml；所用的类器官分化培养基，其配方为：B27 supplement 800μl；R
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spondin1 40μl；Noggin40μl；N2 supplement 400μl；n
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Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；Y27632 40μl；GastrinⅠ20μl；A83
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01 80μl；LY2157299 40μl；Primocin 80μl；DAPT 40μl；DMEM
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F12 37.98ml，共40ml；培养条件为于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
[0026]具体的，所述隐窝悬液离心后弃上清，加入适量类器官生长培养基重悬后计数，计数完成后离心去上清，根据离心管内隐窝干细胞的个数加入适量且提前预冷的基质胶重悬隐窝干细胞，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中孵育30min。
[0027]具体的，待基质胶完全凝固后，加入提前预热的类器官生长培养基，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
[0028]具体的，隔天更换培养基，将类器官生长培养基换为类器官分化培养基，之后隔天换液。
[0029]培养4天左右(具体培养时间根据类器官的大小及数量决定)，可进行传代培养。
[0030]传代后隔天即可看到大量鸭小肠3D类器官，可直接用于实验研究。
[0031]另外，另外上述鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法和鸭小肠3D类器官培养的方法可应用于鸭小肠类器官相关研究中。
[0032]本专利技术的有益效果：1)本专利技术首次在鸭肠道领域提出3D类器官培养，并通过调整消化液的配比与浓度、水平摇床低温消化的时间与次数，优化鸭小肠隐窝干细胞的分离技术，使获得的鸭小肠隐窝干细胞形态更加完整，存活率与出芽率更高；2)本专利技术优化了用于
培养鸭小肠隐窝干细胞的培养基的配方，使鸭小肠隐窝干细胞能更好的分化形成3D类器官；3)本专利技术确定了鸭小肠隐窝干细胞的分离条件与最佳培养方法，为后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；(2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；(3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；(4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。2.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。3.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。4.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。5.一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；(b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；(c)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；(d)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；(e)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；(f)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5
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8min，用PBS洗涤3次，每次3min；(g)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；(h)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。6.权利要求5中鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法在鸭小肠类器官相关研究中的应用。7.一种鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，制备类器官生长培养基和类器官分化培养基，将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液计数后，去上清重悬隐窝干细胞铺于24孔板中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，魏文焯，陈芳，罗祥，吴艳，梁振华，皮劲松，潘爱銮，申杰，杜金平，孙静，黄涛，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：