一种基于iPSC的三维胰岛类器官及其构建方法技术

本发明专利技术公开涉及一种基于多能干细胞(iPSC)构建三维胰岛类器官的方法,属于生物医学技术领域,该方法不使用基质胶，而采用琼脂糖联合结冷胶实现细胞的三维成团成球，再通过在不同诱导时期添加成分明确的化合物，最终诱导出包含全部4种胰岛细胞的三维胰岛类器官，该方法与基质胶方案相比，大幅度降低技术成本、操作简单、流程可重复、均一性好。均一性好。均一性好。

【技术实现步骤摘要】
2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml；
[0015]D液:MCDB131500ml,50％葡萄糖400
‑
600μl,NaHCO30.6
‑
0.7g,BSA 10 g,ITS
‑
X 2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml,肝素5mg, 硫酸锌1.2
‑
1.5mg；
[0016]E液:MCDB131500ml,50％葡萄糖2500
‑
3000μl,NaHCO30.7
‑
0.9g,BSA 10g,ITS
‑
X 2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml,肝素5 mg,硫酸锌1.2
‑
1.5mg。
[0017]S5：将培养基更换成A液并添加结冷胶(0.015
‑
0.02％)、甲基纤维素 (0.2
‑
0.3％)、活化素A(100ng/ml)、CHIR99021(2
‑
4uM)，培养1天。
[0018]S6：将培养基更换成A液并添加结冷胶(0.015
‑
0.02％)、甲基纤维素 (0.2
‑
0.3％)、活化素A(100ng/ml)，培养1天。
[0019]S7：将培养基更换成B液并添加FGF7(30
‑
60ng/ml)，培养2天。
[0020]S8：将培养基更换成C液并添加FGF7(30
‑
60ng/ml)、SANT
‑
1(0.2
‑
0.3 μM)、视黄酸(0.8
‑
1μM)、LDN193189(100
‑
150nM)、RepSox(5
‑
10μ M)、TPB(200
‑
250nM)，培养3天。
[0021]S9：将培养基更换成C液并添加FGF7(30
‑
60ng/ml)、SANT
‑
1(0.2
‑
0.3 μM)、视黄酸(0.8
‑
1μM)、LDN193189(100
‑
150nM)、RepSox(5
‑
10μ M)、TPB(100
‑
120nM)，培养3天。
[0022]S10：将培养基更换成D液并添加SANT
‑
1(0.2
‑
0.3μM)、视黄酸(40
‑
80nM)、 LDN193189(100
‑
150nM)、RepSox(5
‑
10μM)、T3(1
‑
1.2μM)，培养3天
[0023]S11：将培养基更换成E液并添加LDN193189(100
‑
150nM)、GSiXX(80
‑
100 nM)、RepSox(5
‑
10μM)、T3(1
‑
1.2μM)，培养7天；
[0024]S12：将培养基更换成E液并添加Trolox(10
‑
15μM)、R428(2
‑
2.5μM)、 N
‑
乙酰半胱氨酸(1
‑
1.2mM)、RepSox(5
‑
10μM)、T3(1
‑
1.2μM)，培养14 天；
[0025]S13：将培养基更换成E液并添加Trolox(10
‑
15μM)、R428(2
‑
2.5μM)、 N
‑
乙酰半胱氨酸(1
‑
1.2mM)、RepSox(5
‑
10μM)、T3(1
‑
1.2μM)、WNT4 (100
‑
200ng/ml)，培养7天；
[0026]一种基于iPSC的三维胰岛类器官，所述三维胰岛类器官通过琼脂糖联合结冷胶进行构建。
[0027]一种基于iPSC的三维胰岛类器官，所述三维胰岛类器官通过权利要求3所述的培养液培养。
[0028]一种基于iPSC的三维胰岛类器官，所述三维胰岛类器官通过权利要求1
‑
6 所述方法之一进行构建。
[0029]一种糖尿病治疗药品，所述药品包含胰岛素，所述胰岛素通过权利要求7
‑
9 所述三维胰岛类器官之一进行合成。
[0030]有益效果：
[0031]1、本专利技术采用琼脂糖联合结冷胶替代基质胶，实现成本大幅度降低。
[0032]2、操作简单、流程重复性高；本专利技术采用琼脂糖联合结冷胶替代基质胶，操作简单、流程重复性高。基质胶需要
‑
20度保存，每次取用时需要放在冰上融化至少1小时，温度一旦高于10度就会发生凝结，操作不便。而琼脂糖和结冷胶均可常温配制，高压灭菌后可常温长期存放，取用方便。
[0033]3、三维胰岛类器官均一性好；本专利技术采用琼脂糖联合结冷胶替代基质胶，三维胰岛类器官均一性好。基质胶是从小鼠肿瘤中提取的胞外基底膜基质。由于小鼠个体差异，导致不同批次基质胶的成分存在差异，这可能导致三维胰岛类器官均一性较差。采用琼脂糖
联合结冷胶，成分确定，易于工业规模化生产三维胰岛类器官，获得的三维胰岛类器官具有良好的均一性
[0034]4、采用本专利技术的A
‑
E液进行诱导得到的三维胰岛类器官更接近天然胰岛的细胞组成；利用本专利技术获得的三维胰岛类器官，包含了已知的全部4种胰岛细胞，即α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞，与其它方法相比更接近天然胰岛的细胞组成。而其它专利技术仅包含上述细胞中的2
‑
3种，缺少1
‑
2种细胞将导致胰岛功能不全。
附图说明
[0035]为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]图1是本公开实施例1的效果图；
[0037]图2是本公开实施例2的效果图；
[0038]图3是本公开实施例3的效果图。
具体实施方式
[0039]下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。
[0040]实施例1：一种基于多能干细胞(iPSC)的三维胰岛类器官构建技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于iPSC的三维胰岛类器官构建方法，其特征在于，所述三维胰岛类器官通过琼脂糖联合结冷胶实现细胞的三维成团成球。2.根据权利要求1所述的一种基于iPSC的三维胰岛类器官构建方法，包括三维结冷胶培养基的制备，其特征在于，三维结冷胶培养基的制备包括以下步骤；(1)结冷胶粉末(sigma公司)，用超纯水配制成0.3％(w/v)的水溶液，高压灭菌；(2)然后使用mTeSR1溶液(StemCell公司)作为溶剂，添加如下成分配制成三维结冷胶培养基工作液：结冷胶(终浓度0.015
‑
0.02％)，甲基纤维素(终浓度0.2
‑
0.3％)、ROCK inhibitor(终浓度8
‑
15μM)、青链霉素(终浓度1％)。3.根据权利要求1所述的一种基于iPSC的三维胰岛类器官构建方法，其特征在于，所述三维胰岛类器官的培养液包括以下培养液的一种或多种自由组合；A液:MCDB131500ml,50％葡萄糖400
‑
600μl,NaHCO31.2
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1.5g,BSA10g,ITS
‑
X 10μl,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml；B液:MCDB131500ml,50％葡萄糖400
‑
600μl,NaHCO30.6
‑
0.7g,BSA 10g,ITS
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X 10μl,GlutaMax 5ml,维生素C 20
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30mg,青链霉素5ml；C液:MCDB131500ml,50％葡萄糖400
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600μl,NaHCO30.6
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0.7g,BSA 10g,ITS
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X 2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
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30mg,青链霉素5ml；D液:MCDB131500ml,50％葡萄糖400
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600μl,NaHCO30.6
‑
0.7g,BSA 10g,ITS
‑
X 2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml,肝素5mg,硫酸锌1.2
‑
1.5mg；E液:MCDB131500ml,50％葡萄糖2500
‑
3000μl,NaHCO30.7
‑
0.9g,BSA10g,ITS
‑
X 2.5ml,GlutaMax 5ml,维生素C 20
‑
30mg,青链霉素5ml,肝素5mg,硫酸锌1.2
‑
1.5mg。4.根据权利要求3所述的一种基于iPSC的三维胰岛类器官构建方法，其特征在于，所述三维胰岛类器官的培养方法包括：(1)将培养基更换成A液并添加结冷胶(0.015
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0.02％)、甲基纤维素(0.2
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0.3％)、活化素A(100ng/ml)、CHIR99021(2
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4uM)，培养1天。(2)将培养基更换成A液并添加结冷胶(0.015
‑
0.02％)、甲基纤维素(0.2
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0.3％)、活化素A(100ng/ml)，培养1天。(3)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：林昊，孙博，叶正，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：