一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法技术

本发明专利技术公开了一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法，涉及HepG2细胞克隆技术领域。单克隆增强培养基的组分包括RPMI

【技术实现步骤摘要】
一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法


[0001]本专利技术涉及HepG2细胞克隆
，尤其涉及一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法。

技术介绍

[0002]HepG2细胞分离自一个15岁的男性的肝组织，该男性患有分化良好的肝细胞癌，HepG2细胞所含的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性，常用于药物代谢和肝毒性研究，具体为通过ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，从而建立基因敲除、敲入、点突变等细胞株是常用的对HepG2 细胞的研究手段，HepG2细胞的药物代谢和肝毒性研究为后来治疗肝癌疾病研究出了一个巨大的成果。
[0003]随着药物代谢和肝毒性研究的深入，利用CRISPR/Cas9技术介导基因编辑构建HepG2细胞系已经成为研究的主流手段。因此，HepG2细胞单克隆的形成显得越来越重要。目前，HepG2细胞的常规培养条件为：在添加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，并于37℃、5％二氧化碳的环境下进行贴壁培养，在该常规培养条件下，HepG2细胞的单克隆形成率较低，单克隆生长状态不佳，难获得足够的单克隆进行基因型鉴定，制约了基因编辑细胞株的制备效率。

技术实现思路

[0004]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种单克隆增强培养基，采用该单克隆增强培养基，HepG2细胞的单克隆形成率显著提高，这一专利技术解决了常规培养条件下HepG2细胞的单克隆形成率较低的问题。
[0005]本专利技术的另一目的在于提出一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，能显著提高HepG2细胞的单克隆形成率，解决了常规培养条件下HepG2细胞的单克隆形成率较低的问题。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，所述单克隆增强培养基的组分包括RPMI
‑
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子
‑
1。
[0008]进一步的，按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10％；
[0009]所述肝细胞生长因子的添加量为1～10ng/mL，所述胰岛素样生长因子
‑
1的添加量为1～10ng/mL。
[0010]优选的，所述RPMI
‑
1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。
[0011]优选的，按照总原料的体积百分比计算，所述单克隆增强培养基的组分还包括1％的非必需氨基酸溶液。
[0012]一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，使用上述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，包括以下步骤：
[0013](1)将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养；
[0014](2)将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液进行有限稀释后加入到96孔细胞培养板中进行培养；
[0015](3)待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，继续培养形成单克隆。
[0016]进一步的，所述步骤(2)的操作如下：将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，按照每次10倍的稀释比例将细胞悬液逐级稀释至1个细胞/100μL基础培养基的浓度，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
[0017]进一步的，所述步骤(3)的操作如下：待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，于37℃和5％CO2的环境下进行培养，每4～6d更换新鲜的单克隆增强培养基，培养15～17d后形成单克隆。
[0018]进一步的，在所述步骤(1)中，HepG2细胞进行原代培养的操作如下：将冻存的HepG2细胞融化后移至完全培养液中，离心后收集HepG2细胞；用新鲜的完全培养液重悬细胞至单细胞悬液后，转移至装有完全培养液的培养瓶中进行培养。
[0019]进一步的，在所述步骤(1)中，HepG2细胞进行传代培养的操作如下：用胰酶将原代培养后的HepG2细胞消化成单细胞后，离心收集HepG2细胞，用完全培养基重悬HepG2细胞；将重悬后的HepG2细胞按照1:3的接种比例进行传代，并于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
[0020]以上技术方案的有益效果为：
[0021]1、本技术方案中的单克隆增强培养基为由RPMI
‑
1640培养基和DMEM培养基组成的复合培养基，采用该复合培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆能不仅有效提高单克隆形成率，而且在单细胞克隆过程中，HepG2细胞形态正常，生长速度快，同时在单克隆增强培养基中添加胎牛血清、肝细胞生长因子(HGF) 和胰岛素样生长因子
‑
1(IGF1)，通过RPMI
‑
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、HGF和IGF1的协同作用，能进一步的提高HepG2细胞的单克隆形成率。
[0022]2、本技术方案通过在单克隆增强培养基中添加1％非必需氨基酸溶液，能进一步提高HepG2细胞的克隆形成率，使得HepG2细胞的克隆形成率增加1％～3％。
附图说明
[0023]图1是采用现有常规培养基培养7d后的HepG2细胞单克隆形态(常规培养基是指添加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基)；
[0024]图2是采用实施例2中的单克隆增强培养基培养7d后HepG2细胞单克隆形态。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施方式进一步说明本专利技术的技术方案。
[0026]一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，单克隆增强培养基的组分包括RPMI
‑
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子
‑
1。
[0027]通过采用本技术方案中的单克隆增强培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆培养，
能有效提高HepG2细胞的单克隆形成率。
[0028]具体来说，本技术方案中的单克隆增强培养基为由RPMI
‑
1640培养基和 DMEM培养基组成的复合培养基，采用该复合培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆能不仅有效提高单克隆形成率，而且在单细胞克隆形成过程中，HepG2 细胞形态正常，生长速度快，同时在单克隆增强培养基中添加胎牛血清、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素样生长因子
‑
1(IGF1)，通过RPMI
‑
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、HGF和IGF1的协同作用，能进一步的提高HepG2 细胞的单克隆形成率。
[0029]值得说明的是，HGF是一种旁分泌细胞生长、运动和形态发生因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，所述单克隆增强培养基的组分包括RPMI
‑
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子
‑
1。2.根据权利要求1所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10％；所述肝细胞生长因子的添加量为1～10ng/mL，所述胰岛素样生长因子
‑
1的添加量为1～10ng/mL。3.根据权利要求1所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，所述RPMI
‑
1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。4.根据权利要求1所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，按照总原料的体积百分比计算，所述单克隆增强培养基的组分还包括1％的非必需氨基酸溶液。5.一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，使用如权利要求1
‑
4中任意一项所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，包括以下步骤：(1)将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养；(2)将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液进行有限稀释后加入到96孔细胞培养板中进行培养；(3)待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秋凤，郑虹，李榕贞，
申请(专利权)人：广州源井生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：