一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法技术

一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法，属于生物细胞提取技术领域。本发明专利技术所分离提取的肠上皮细胞、上皮间免疫细胞、肠固有层免疫细胞得率高、活性高，可广泛应用于肠道机械屏障和免疫屏障相关研究。本发明专利技术分离提取步骤相较于现有方法简单，耗时极大减少，一般在3.5小时左右即可完成单细胞的分离与提纯，有助于更高效开展后续研究。有助于更高效开展后续研究。有助于更高效开展后续研究。

【技术实现步骤摘要】
一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法


[0001]本专利技术属于生物细胞提取
，具体是涉及一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法。

技术介绍

[0002]肠道不仅是人体吸收营养的重要器官，也是人体对抗微生物感染的重要屏障。在肠道对抗微生物感染过程中，存在微生物屏障、黏液屏障、机械屏障和免疫屏障四大保护屏障。微生物屏障主要是人体正常菌群，黏液屏障主要由肠道分泌的粘蛋白和免疫球蛋白等组成，机械屏障主要由肠上皮细胞间紧密连接形成，免疫屏障则由肠道局部免疫细胞和物质构成。肠道在组织学层面上共分为4层：黏膜层、黏膜下固有层、肌层和浆膜层。其中黏膜下固有层含有丰富的免疫细胞，是肠道免疫屏障的主要组成之一，此外黏膜层上皮间免疫细胞也具有重要作用。肠道四大屏障，尤其是最后的机械屏障和免疫屏障与机体健康和疾病状态联系密切，但是相关机制仍存在诸多未解之谜。因此，分离肠上皮细胞、上皮间免疫细胞和固有层免疫细胞，对于研究肠道与疾病的机制、临床诊断与治疗具有十分重大的意义。
[0003]由于人体小肠临床标本不易获得，小鼠作为当前科学研究的重要模式动物之一，被广泛应用于小肠相关研究。现有技术中，存在多种解离小鼠小肠组分的方法，主要过程为多次振荡分离肠上皮，利用多类消化酶长时间消化。但是这些方法不一而同地存在分离步骤繁琐、耗时长达6
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10小时，导致细胞得率和活性低，大大限制了基于分离所得细胞的后续研究。因此非常有必要开发一种简洁、省时、高效、细胞得率和活性高的分离小鼠小肠各细胞组分的技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法。
[0005]本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]步骤1，取小鼠小肠，将其清洗干净后，剪碎至0.5
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1cm片段，将剪碎的小肠转移至50ml离心管中，加入预热后温度为37℃的IEC分离液10ml，然后以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化15min；
[0007]步骤2，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡15S，至上清乳糜色，分离肠上皮细胞和上皮间免疫细胞；
[0008]步骤3，用100μm滤膜过滤，取小肠碎片，用2mlIEC分离液清洗小肠碎片；滤膜过滤后的滤过液盛于50ml离心管并冰上暂存；小肠碎片再用10mlIEC分离液以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化15min，同步骤2方法振荡后，过滤清洗小肠碎片并取小肠碎片，两次过滤后的滤过液相混合后离心，离心机转速600G，温度4℃，离心时间10min，取细胞沉淀；
[0009]步骤4，用PBS彻底漂洗小肠碎片以去除残留的EDTA；
[0010]步骤5，将小肠碎片转移至50ml离心管内，加入预热后温度为37℃的LP消化液，然后以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化45min，消化完成后小肠碎片明显变小变少；
[0011]步骤6，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡15S，将100μm细胞筛用PBS预湿润后进行过滤，取过滤上清液，用PBS清洗小肠碎片；
[0012]步骤7，将上清液离心，离心机转速600G，温度4℃，离心时间10min，取细胞沉淀；
[0013]步骤8，15ml离心管内预放4ml 70％浓度Percoll，将步骤3的细胞沉淀用4ml 40％浓度Percoll重悬，使用胶头滴管吸取混悬液，并滴加到70％浓度Percoll上层，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；然后再在40％浓度Percoll上层滴加20％浓度Percoll，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；
[0014]步骤9，将15ml离心管密度梯度离心，离心机升3降1，转速800G，温度20℃，离心时间20min；离心后，吸取20％浓度Percoll和40％浓度Percoll分界面处呈白色环状的肠上皮细胞层至一个15ml离心管内；吸取40％浓度Percoll和70％浓度Percoll分界面处呈白色环状的上皮间免疫细胞层至另一个15ml离心管内；吸取量控制在2ml以内；
[0015]步骤10，用PBS分别清洗肠上皮细胞、上皮间免疫细胞两次，然后用缓冲液重新悬浮，即得到肠上皮细胞和上皮间免疫细胞；
[0016]步骤11，15ml离心管内预放4ml 70％浓度Percoll，将步骤7的细胞沉淀用4ml 40％浓度Percoll重悬，使用胶头滴管吸取混悬液，并滴加到70％浓度Percoll上层，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；
[0017]步骤12，将15ml离心管密度梯度离心，离心机升3降1，转速800G，温度20℃，离心时间20min；离心后，吸取40％浓度Percoll和70％浓度Percoll分界面处呈白色环状的细胞层至15ml离心管内，即为固有层免疫细胞层；吸取量控制在2ml以内；
[0018]步骤13，用PBS清洗固有层免疫细胞两次，然后用缓冲液重新悬浮，即得到固有层免疫细胞。
[0019]作为优选，在步骤1中，小鼠小肠清洗包括如下步骤：
[0020]步骤S1，顺小肠生理解剖去除肠系膜、小肠外脂肪、结缔组织和淋巴组织后，置于含2％血清的冰PBS中；
[0021]步骤S2，在冰PBS下，剪除潘氏节，然后用1ml枪头套在小肠的一端，使用冰PBS冲净肠内容物；
[0022]步骤S3，纵向剪开小肠，用冰PBS漂洗后转入50ml离心管内，在50ml离心管内加入15ml冰PBS后置于振荡器进行振荡15S，直至小肠内外面干净。
[0023]作为优选，在步骤4中，PBS漂洗小肠碎片包括如下步骤：
[0024]步骤S1，将小肠碎片转移至培养皿，用PBS漂洗后转入50ml离心管，在50ml离心管内加入20mlPBS后进行上下颠倒漂洗，然后取70μm滤器过滤清洗小肠碎片并弃上清；
[0025]步骤S2，将小肠碎片转入50ml离心管，在50ml离心管内加入20mlPBS后进行上下颠倒漂洗，然后取70μm滤器过滤清洗小肠碎片并弃上清；
[0026]步骤S3，将小肠碎片转入50ml离心管，在50ml离心管内加入15mlHBSS后进行上下颠倒漂洗，然后取70μm滤器过滤清洗小肠碎片并弃上清。
[0027]作为优选，在步骤10中，PBS清洗肠上皮细胞和上皮间免疫细胞包括如下步骤：
[0028]步骤S1，分别用PBS重悬肠上皮细胞和上皮间免疫细胞定容至15ml，然后离心机离心，转速600G，离心时间10min；
[0029]步骤S2，分别用1mlPBS重悬肠上皮细胞和上皮间免疫细胞沉淀至1.5mlEP管，然后离心机离心，转速600G，离心时间5min。
[0030]作为优选，在步骤13中，PBS清洗固有层免疫细胞包括如下步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，取小鼠小肠，将其清洗干净后，剪碎至0.5
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1cm片段，将剪碎的小肠转移至50ml离心管中，加入预热后温度为37℃的IEC分离液10ml，然后以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化15min；步骤2，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡15S，至上清乳糜色，分离肠上皮细胞和上皮间免疫细胞；步骤3，用100μm滤膜过滤，取小肠碎片，用2mlIEC分离液清洗小肠碎片；滤膜过滤后的滤过液盛于50ml离心管并冰上暂存；小肠碎片再用10mlIEC分离液以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化15min，同步骤2方法振荡后，过滤清洗小肠碎片并取小肠碎片，两次过滤后的滤过液相混合后离心，离心机转速600G，温度4℃，离心时间10min，取细胞沉淀；步骤4，用PBS彻底漂洗小肠碎片以去除残留的EDTA；步骤5，将小肠碎片转移至50ml离心管内，加入预热后温度为37℃的LP消化液，然后以37℃，转速200rpm的条件在摇床上消化45min，消化完成后小肠碎片明显变小变少；步骤6，将50ml离心管从摇床取下，置于振荡器内进行振荡15S，将100μm细胞筛用PBS预湿润后进行过滤，取过滤上清液，用PBS清洗小肠碎片；步骤7，将上清液离心，离心机转速600G，温度4℃，离心时间10min，取细胞沉淀；步骤8，15ml离心管内预放4ml 70％浓度Percoll，将步骤3的细胞沉淀用4ml 40％浓度Percoll重悬，使用胶头滴管吸取混悬液，并滴加到70％浓度Percoll上层，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；然后再在40％浓度Percoll上层滴加20％浓度Percoll，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；步骤9，将15ml离心管密度梯度离心，离心机升3降1，转速800G，温度20℃，离心时间20min；离心后，吸取20％浓度Percoll和40％浓度Percoll分界面处呈白色环状的肠上皮细胞层至一个15ml离心管内；吸取40％浓度Percoll和70％浓度Percoll分界面处呈白色环状的上皮间免疫细胞层至另一个15ml离心管内；吸取量控制在2ml以内；步骤10，用PBS分别清洗肠上皮细胞、上皮间免疫细胞两次，然后用缓冲液重新悬浮，即得到肠上皮细胞和上皮间免疫细胞；步骤11，15ml离心管内预放4ml 70％浓度Percoll，将步骤7的细胞沉淀用4ml 40％浓度Percoll重悬，使用胶头滴管吸取混悬液，并滴加到70％浓度Percoll上层，避免二者混合，使之形成明显的液面分界；步骤12，将15ml离心管密度梯度离心，离心机升3降1，转速800G，温度20℃，离心时间20min；离心后，吸取40％浓度Percoll和70％浓度Percoll分界面处呈白色环状的细胞层至15ml离心管内，即为固有层免疫细胞层；吸取量控制在2ml以内；步骤13，用PBS清洗固有层免疫细胞两次，然后用缓冲液重新悬浮，即得到固有层免疫细胞。2.根据权利要求1所述一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法，其特征在于，在步骤1中，小鼠小肠清洗包括如下步骤：步骤S1，顺小肠生理解剖去除肠系膜、小肠外脂肪、结缔...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁廷波，张匀，张承，陈诗音，张剑，谢雨婷，俞文桥，洪晓洁，刘春晓，傅淑蕾，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：