一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法技术

本发明专利技术提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养。本发明专利技术成功建立了一种鼻粘膜类器官诱导分化模型，形成一个标准规范化上皮类器官培养体系。该体系可以使通过鼻息肉获得的鼻粘膜原代上皮细胞在体外持续扩增传代、分化发育超过60天，成为同时具有长期增殖及多细胞群分化能力的上呼吸道类器官。官。官。

【技术实现步骤摘要】
一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，具体涉及一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法。

技术介绍

[0002]既往已有众多国内外学者讨论了上呼吸道原代培养的方法，然而均无法做到长期体外培养以及维持原代细胞的分化能力。目前鼻粘膜体外模型主要分为2D原代细胞模型、2D肿瘤细胞系及器官外植体模型。2D原代单层上皮细胞间缺少细胞外基质，中断细胞间连接从而限制了细胞的分化发育，致使其不具有体内器官组织的立体结构及多种细胞类型；2D肿瘤细胞系中许多信号通路都发生了改变，无法用作患者个体化的研究模型；而器官型外植体模型培养过程中遗传变异和不可控的环境变量导致其可重复性不高，因此上述模型在鼻粘膜上皮生理功能及相关疾病的研究中仍具有较大的局限性。类器官是指体外3D培养胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞，通过自我更新自我组织形成具有类似于来源器官组织形态结构、功能及遗传学特征的培养物，在保持基因组和蛋白质组稳定的情况下，能够长期进行体外培养。类器官的核心在于干细胞群，其具有自我组织能力，通过调节细胞
‑
细胞和细胞
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细胞外基质的相互作用，完成细胞群体的自发排序，最大程度上模拟器官发生发展的基本过程，能够再现来源器官的空间结构及某些特定功能(例如，排泄，过滤，神经活动，收缩)。由于正常鼻粘膜组织不易获取，可能会涉及医学伦理问题，因而导致在鼻粘膜类器官上的研究比较滞后。鼻息肉是慢性炎症导致鼻粘膜组织间隙的极度水肿，在中鼻道形成单发或多发息肉，基底细胞自我更新和定向分化干性潜能并未破坏，在去除炎性因子的干细胞培养体系内，wnt/β
‑
catenin信号通路激活，可自组装形成正常的鼻粘膜结构。本专利技术拟利用鼻息肉手术剩余组织实现体外长期培养鼻粘膜类器官，为鼻粘膜类器官的研究提供一种新的研究思路。

技术实现思路

[0003]针对目前鼻粘膜类器官研究技术的滞后和局限性，本专利技术提供一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法。本专利技术的技术方案为：
[0004]一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养。
[0005]进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
[0006]步骤1，将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，然后将组织置于含2％(v/v)双抗的生理盐水中反复振荡洗涤几次；
[0007]步骤2，将洗涤后的组织加入HBSS缓冲液，15min内将其处理成1～2mm3的组织碎块；
[0008]步骤3，在组织碎块中加入消化液I，于37℃恒温消化1～3h，之后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；
[0009]步骤4，在步骤3获得的沉淀中加入消化液II，于37℃恒温消化8～12min后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；
[0010]步骤5，在步骤4获得的沉淀中加入HBSS缓冲液重悬沉淀，用100μm滤网过滤并离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀；
[0011]步骤6，在鼻粘膜上皮细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解，之后加入HBSS缓冲液终止裂解，离心后获得细胞沉淀；
[0012]步骤7，在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12培养基混匀，再加入基质胶混匀，形成胶滴后接种于培养皿中静置，凝固后于37℃恒温倒置一段时间，之后加入扩增培养基于37℃、5％CO2条件下扩增培养5～7天，每间隔2
‑
3天更换一次扩增培养基；
[0013]步骤8，扩增培养后在体系中加入分化培养基继续培养13～18d，分化培养基隔天更换一次，即得。
[0014]进一步地，所述步骤1中将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，是将鼻息肉置于8～12mMol/L的DTT溶液中作用10～20min，再用无菌医用棉签蘸取式去除表面剩余粘液。
[0015]进一步地，所述步骤3中消化液I按照终浓度的组成为：100～120U/mL的hyaluronidase，200～250U/mL的collagenase III，10～15％的FBS。
[0016]进一步地，所述步骤4中消化液II按照终浓度的组成为：0.1～0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，10～15ng/mLEGF，10～15％的FBS。
[0017]进一步地，所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit
‑
A的B27，0.5
‑2×
；N
‑
acetylysteine，1
‑
3mM；EGF，50
‑
500ng/mL；Noggin，50
‑
500ng/mL；R
‑
spondin1，50
‑
1000ng/mL；A83
‑
01，200
‑
500nM；Nicotinamide，10
‑
50mM；Glutmax，1
‑5×
；Gastrin，10nM
‑
50nM；青霉素
‑
链霉素100
×
溶液，1
‑3×
；SB202190，10
‑
50μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0018]优选地，所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit
‑
A的B27，1
×
；N
‑
acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R
‑
spondin 1，250ng/mL；A83
‑
01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1
×
；Gastrin，10nM；青霉素
‑
链霉素100
×
溶液，1
×
；SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。
[0019]可选地，所述扩增培养基还包括：CHIR99021，1
‑
4uM；FGF4，100
‑
600ng/mL。优选为：CHIR99021，2uM；FGF4，200ng/mL。
[0020]进一步地，所述分化培养基按照终浓度组成包括：不含Vit
‑
A的B27，0.5
‑2×
；N
‑
acetylysteine，1
‑
3mM；EGF，10～100ng/mL；Noggin，50
‑
500ng/mL；R
‑
spondin1，50
‑
1000ng/mL；A83
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01，200
‑
500n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：是将获取的鼻息肉组织处理得到细胞沉淀，再将细胞沉淀依次在扩增培养基和分化培养基中进行培养。2.根据权利要求1所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：步骤1，将获得的鼻息肉组织表面粘液先去除，然后将组织置于含2％(v/v)双抗的生理盐水中反复振荡洗涤几次；步骤2，将洗涤后的组织加入HBSS缓冲液，15min内将其处理成1～2mm3的组织碎块；步骤3，在组织碎块中加入消化液I，于37℃恒温消化1～3h，之后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；步骤4，在步骤3获得的沉淀中加入消化液II，于37℃恒温消化8～12min后加入HBSS缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；步骤5，在步骤4获得的沉淀中加入HBSS缓冲液重悬沉淀，用100μm滤网过滤并离心，得到鼻粘膜上皮细胞沉淀；步骤6，在鼻粘膜上皮细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解，之后加入HBSS缓冲液终止裂解，离心后获得细胞沉淀；步骤7，在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12培养基混匀，再加入基质胶混匀，形成胶滴后接种于培养皿中静置，凝固后于37℃恒温倒置一段时间，之后加入扩增培养基于37℃、5％CO2条件下扩增培养5～7天，每间隔2
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3天更换一次扩增培养基；步骤8，扩增培养后在体系中加入分化培养基继续培养13～18d，分化培养基隔天更换一次，即得。3.根据权利要求2所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述步骤3中消化液I按照终浓度的组成为：100～120U/mL的hyaluronidase，200～250U/mL的collagenase III，10～15％的FBS。4.根据权利要求2所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述步骤4中消化液II按照终浓度的组成为：0.1～0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，10～15ng/mLEGF，10～15％的FBS。5.根据权利要求1或2所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit
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A的B27，0.5
‑2×
；N
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acetylysteine，1
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3mM；EGF，50
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500ng/mL；Noggin，50
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01，200
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500nM；Nicotinamide，10
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50mM；Glutmax，1
‑5×
；Gastrin，10nM
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50nM；青霉素
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链霉素100
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溶液，1
‑3×
；SB202190，10
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50μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养液中。6.根据权利要求5所述的一种利用鼻息肉组织培养人类上呼吸道类器官的方法，其特征在于：所述扩增培养基按照终浓度组成包括：不含Vit
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A的B27，1
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；N
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acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R
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spondin 1，250ng/mL；A83
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01，500nM；Nicotin...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，汪珂，于言，韩日，王伟佳，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：