用于增进Wnt蛋白的活性的培养基组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于增进Wnt蛋白的活性及培养类器官的培养基组合物以及利用其的类器官培养方法。养方法。养方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增进Wnt蛋白的活性的培养基组合物


[0001]本专利技术涉及用于增进Wnt蛋白的活性及培养类器官的培养基组合物以及利用其的类器官培养方法。

技术介绍

[0002]类器官制备技术在理论上仅使用干细胞就可以制备几乎所有种类的器官，因此可以应用于多种疾病。与二维细胞组织相比，类器官可以在新药的安全性和功效的试验中更为有效，认为可以运用其将类器官移植到损伤或发育不好的器官中来改善状态。因此，近年来在再生医学领域也呈现出类器官相关研究日益活跃的趋势，展望未来，类器官可以广泛应用于多个领域中。
[0003]另一方面，作为制备类器官必需因子中的一种的Wnt蛋白通常以脂质与保守的Ser残基共价键合的形式存在。Wnt蛋白因所结合的脂质而带有强疏水性(hydrophobic)而凝集，因此难以分离为纯蛋白质来使用。于是，随着查明在利用加入胎牛血清(Fetal brovine serum，FBS)的培养基的情况下可以获得稳定的Wnt蛋白，在类器官的制备中一直在利用包含胎牛血清的Wnt蛋白。
[0004]然而，胎牛血清包含抑制类器官生长的物质，在长时间培养类器官的情况下，仍具有不适合的问题。因此，需要开发在保持Wnt蛋白的活性的同时也能够持续生长的培养基。并且，若从包含胎牛血清的Wnt生产培养基中纯化Wnt，则无法避免受到动物性杂质的污染，给制备用于人类的Wnt治疗剂材料带来很大的限制，因此需要开发不包含胎牛血清的Wnt生产培养基。

技术实现思路

[0005]技术问题
[0006]本专利技术的目的在于，提供用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，包含基础培养基、Wnt蛋白或其表达细胞、Afamin或其表达细胞及白蛋白(albumin)作为有效成分。
[0007]本专利技术的再一目的在于，提供利用上述培养基组合物的类器官获得方法。
[0008]本专利技术的另一目的在于，提供用于增进生物学试样中Wnt蛋白的活性的组合物或者用于使生物学试样中Wnt蛋白稳定化的组合物。
[0009]本专利技术的其他目的及优点将通过下述专利技术的详细说明、专利技术要求保护范围及附图得到进一步明确。
[0010]技术方案
[0011]为了实现上述目的，本专利技术的一实施方式涉及一种用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，包含基础培养基、Wnt蛋白或其表达细胞、Afamin或其表达细胞及白蛋白作为有效成分。
[0012]在本专利技术中，“培养基(culture media)”是指能够支持细胞生长及生存的培养基，
包括为适合细胞培养而使用的所有通常的培养基。
[0013]根据本专利技术的具体实例，本专利技术的培养基可以为无血清培养基。
[0014]在本专利技术中，“无血清培养基”是指不包含血清或者血清含量小于在培养环境中能够发挥血清的生物学及生理学功能的有效量的培养基。血清为胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)、小牛血清(FCS，fetal calf serum)、透析胎牛血清(dialyzed fetal bovine serum)、新生牛血清(newborn calfserum，NCS)等通常的细胞培养中所包含的血清(serum)的统称。血清包含对于广泛的高分子蛋白质、低分子营养成分、不溶性物质的运载体、激素等，添加到普通基础培养基的情况较多，但本专利技术的培养基组合物不包含血清或者含量小于有效量也可以使培养类器官等所需的Wnt蛋白保持活性状态。
[0015]在本专利技术中，“Wnt蛋白”在多数细胞类型中给增殖及分化的均衡带来影响，是一种与骨形成、免疫调节、癌症、干细胞再生等相关的富含半胱氨酸的分泌的多肽系列的蛋白质。尤其在动物细胞中，Wnt蛋白依赖性Wnt信号转导通路对组织和器官形成的调节非常重要。
[0016]上述Wnt蛋白作为类器官制备必需的生长因子中的一种，包括Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11及Wnt16。具体地，上述Wnt蛋白可以为Wnt3a蛋白。
[0017]在本专利技术中，“Afamin”作为具有体液中疏水性分子的运载体功能的糖蛋白，是一种包括Wnt1、Wnt2B、Wnt3、Wnt3A、Wnt5A、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A和/或Wnt10B在内的脂质化的Wnt家族的活性及溶解所必需的蛋白质。此外，通过与维生素E结合来参与在脂质蛋白系统不充分的条件下转运维生素E或者可以穿过血脑屏障(Blood
‑
brain barrier，BBB)转运维生素E。
[0018]编码Afamin的基因，即AFM基因为编码人类Afamin(e.g.,NCBI Accession No.NP_001124)或者小鼠Afamin(NP_660128)的基因，例如，可以为由NCBI Accession No.NM_001133、NM_145146表达的基因，但不限定于此。
[0019]根据本专利技术，本专利技术人最先查明了白蛋白与Afamin的组合在保持培养液中Wnt蛋白的稳定性和活性方面起到核心作用的事实。在本专利技术的培养基中，Wnt蛋白和Afamin能够以肽形式加入培养基中，也可以通过共培养表达Wnt蛋白和/或Afamin蛋白的细胞的方式提供。
[0020]在本说明书中，“表达Wnt蛋白(Afamin)的细胞”包括所有内源性地(endogenously)表达Wnt蛋白(Afamin)的细胞和通过基因载体导入各蛋白质的编码核酸分子的转导(transfection)细胞。
[0021]在本说明书中，术语“核酸分子”为以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，若无特别说明，则包括自然的核苷酸类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543
‑
584(1990))。
[0022]在本说明书中，术语“基因载体”是指用于将所希望的目标基因导入对象细胞来表达的媒介。理想的基因载体应对人体无害且易于大量生产，并且能够有效传递基因。
[0023]在本说明书中，术语“基因传递”是指向细胞内转运基因，具有基因向细胞内渗透(转导(transduction))相同的含义。从细胞及组织水平来说，基因传递具有与基因的扩散(spread)相同的含义。因此，本专利技术的基因载体也可以描述为基因渗透系统及基因扩散系
统。
[0024]在Wnt蛋白和Afamin以利用其表达细胞的重组形式来提供的情况下，两种蛋白质可以通过互不相同的宿主细胞来表达，也可以在一个宿主细胞中共表达(co
‑
expression)。
[0025]在本专利技术中，“白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，包含基础培养基、Wnt蛋白或其表达细胞、Afamin或其表达细胞及白蛋白作为有效成分。2.根据权利要求1所述的用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，上述Wnt蛋白为Wnt3a蛋白。3.根据权利要求1所述的用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，以0.1mg/mL至20mg/mL的浓度包含上述白蛋白。4.根据权利要求1所述的用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，上述器官类似物为类器官。5.根据权利要求1所述的用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，上述培养基组合物为无血清培养基组合物。6.根据权利要求1所述的用于培养细胞、细胞聚集体、组织片段或器官类似物的培养基组合物，其特征在于，上述基础培养基为选自由改良杜氏伊格尔培养基、最低基础培养基、基础Eagle培养基、RPMI1640、F
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10、F
‑
12、DMEM
‑
F12、α
‑
最低基础培养基、格拉斯哥的最低基础培养基、伊斯科夫改良...

【专利技术属性】
技术研发人员：李真遇，金哲薰，权纯成，吕珠慧，
申请(专利权)人：INTERPARKBIO融合株式会社，
类型：发明
国别省市：