于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法技术

本申请公开了一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，污染条件包括肠道包含细菌数不低于105cfu/m3以及所述方法实施环境中浮游微生物不低于104cfu/L，该方法包括对肠道组织块进行消化、密度梯度离心得到纯化的上皮细胞步骤。本申请适用于不同年龄阶段和生理状态的不同种属动物(新生和已采食动物均可)肠道上皮细胞的分离纯化，且无需控制和使用无菌提取条件及细胞传代纯化技术，操作方法快速、简便、高效，所用仪器设备为实验常规仪器设备，成本低廉，在医学、动物学、营养学等领域的研究以及试剂盒的研发等具有重要的指导意义。试剂盒的研发等具有重要的指导意义。试剂盒的研发等具有重要的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法


[0001]本申请涉及肠道上皮细胞分离
，尤其涉及一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，适用于不同年龄阶段和生理状态的不同种属动物(新生和已采食动物均可)现场有菌条件下获取肠道上皮细胞。

技术介绍

[0002]肠道上皮细胞是肠道主要功能性细胞，在肠道营养物质消化吸收、构成肠道免疫屏障抵御细菌等病原体的入侵以及应急反应中均发挥着重要的作用。由于肠道经常经受食物和药物等等异物的刺激，其微环境中存在着强大的抗感染生物因素。由于受这种特殊的生长条件限制，肠道上皮细胞原代培养较难。
[0003]现有技术对于肠道上皮细胞的分离纯化方法主要有酶消化法和组织块，这些方法虽然能提成和分离得到上皮细胞，但是这些操作过程较为繁琐，耗时较长，获取细胞纯度和活细胞数量较低，并且对于一些有污染的肠道或者已经产生肿瘤的肠道，其提取和分离得到的上皮细胞纯度不够，无法满足对于其继续传代培养的要求。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请的目的在于建立一种快速、简便、高效，且适用于污染条件下的肠道上皮细胞的分离纯化，在医学、动物学、营养学等领域的研究以及试剂盒的研发等具有重要的指导意义。
[0005]本专利技术的专利技术人深入研究比较了国内外不同种属动物肠道上皮细胞分离、纯化、以及原代培养等多种方法，通过大量的实验摸索，专利技术了适用于不同种属动物(不同年龄，不同生理阶段)肠道上皮细胞的分离纯化方法，适合现场有菌条件下提取，更能反映出肠道上皮细胞机能的实际情况，为动物肠道上皮细胞的结构、发育以及物种进化等研究奠定基础。此方法可应用于大鼠、猪、鸡、鸭、鹅、狗、骆驼、牛、马、羊、兔、猴、虎、猫、熊猫、人等肠道上皮的提取、分离及纯化。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]本申请实施例公开了一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，所述污染条件包括肠道以活菌计数计包含细菌数不低于105cfu/m3、以及所述方法实施环境中采用GB/T16293
‑
2010《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》检测浮游微生物不低于104cfu/L，所述方法包括以下步骤：
[0008]得到去除组织周围的结缔组织和脂肪的肠道组织块；
[0009]将所述肠道组织块用0.05～0.25％胰酶消化处理，并用完全培养液终止消化，以得到组织消化液；
[0010]将所述组织消化液依次通过100μm细胞滤器和70μm细胞过滤器，离心，得到第一细胞沉淀；
[0011]将所述第一细胞沉淀用样本稀释液重悬至浓度为2
×
108～1
×
109个/mL，进行密度
梯度离心，即可得到第二细胞沉淀。
[0012]在本申请实施例中，在对所述肠道组织块进行消化的处理条件为温度
‑
4～40℃，消化0
‑
3h；在对所述组织消化液过滤后的离心条件为400～500g离心10～15min。
[0013]在本申请实施例中，所述样本稀释液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述样本稀释液的pH 7.2～7.5；所述完全培养基为包含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基。
[0014]在本申请实施例中，所述方法还包括对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤。
[0015]在本申请实施例中，对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤具体包括：
[0016]将所述第二细胞沉淀用样本稀释液重悬后，400～500g离心10～15min，弃上清；
[0017]加入0.5～1.0mL 4℃预冷的固定剂，室温或37℃孵育5～30min；
[0018]400～500g离心10～15min，弃上清；
[0019]加入预冷PBS洗涤；
[0020]加入1.0～3.0mL破膜剂室温或37℃孵育5～15min，400～500g离心10～15min，弃上清；
[0021]加入0.1～1.0mL重悬液后，完成细胞计数；
[0022]加1～10μL浓缩型血清，37℃孵育5～30min，洗涤；
[0023]加入KRT8抗体室温或37℃孵育30～120min，400～500g离心10～15min，弃上清，加1mL PBS重悬清洗2次；
[0024]加入荧光二抗，37℃避光孵育30～60min，400～500g离心10～15min，弃上清，加1mL PBS清洗2次，弃上清，加0.1mL PBS，混匀，最后上机检测。
[0025]在本申请实施例中，所述方法还包括对所述肠道组织块进行冻存与复苏的步骤。
[0026]在本申请实施例中，对所述肠道组织块进行冻存的步骤具体包括：
[0027]将所述肠道组织块装入冻存管中，加入冻存液，封口，置于4℃冰箱30min，随后放入
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20℃冰箱1.5h，最后放入
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80冰箱保存；
[0028]对所述肠道组织块进行复苏的步骤具体包括：将细胞冻存管从
‑
80℃冰箱取出后迅速至于37℃水浴锅中，并摇动冻存管，使之迅速融化，取出组织块，用PBS缓冲液清洗干净，用于后续上皮细胞的分离、纯化及鉴定。
[0029]其中，所述PBS缓冲溶液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述PBS缓冲液的pH为7.2～7.5。
[0030]其中，所述细胞冻存液为无血清细胞冻存液或含有10％二甲基亚砜、90％胎牛血清的混合溶液。
[0031]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0032]本申请实施例公开的方法可对污染条件的肠道上皮细胞进行有效的分离，得到的上皮细胞纯度高；并且本申请实施例提供的方法无需控制无菌提取条件和使用细胞传代纯化技术，操作方法快速、简便、高效，所用仪器设备为实验常规仪器设备，成本低廉。
附图说明
[0033]图1为本申请实施例提供的大鼠空肠上皮细胞鉴定图。
[0034]图2为本申请实施例提供的猪空肠上皮细胞鉴定图。
[0035]图3为本申请实施例提供的羊十二指空肠上皮细胞鉴定图。
[0036]图4为本申请实施例提供的兔回肠上皮细胞鉴定图。
具体实施方式
[0037]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
[0038]实施例1大鼠肠道上皮细胞的提取与分离
[0039]1、材料
[0040]8周龄SD大鼠6只，购自南方医科大学实验动物中心。选取SD大鼠6只，短颈处死取出小肠肠段，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，所述污染条件包括肠道以活菌计数计包含细菌数不低于105cfu/m3、以及所述方法实施环境中采用GB/T16293
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2010《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》检测浮游微生物不低于104cfu/L，所述方法包括以下步骤：得到去除组织周围的结缔组织和脂肪的肠道组织块；将所述肠道组织块用0.05～0.25％胰酶消化处理，并用完全培养液终止消化，以得到组织消化液；将所述组织消化液依次通过100μm细胞滤器和70μm细胞过滤器，离心，第一细胞沉淀；将所述第一细胞沉淀用样本稀释液重悬至浓度为2
×
108～1
×
109个/mL，进行密度梯度离心，即可得到第二细胞沉淀。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对所述肠道组织块进行消化的处理条件为温度
‑
4～40℃，消化0
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3h；在对所述组织消化液过滤后的离心条件为400～500g离心10～15min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本稀释液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述样本稀释液的pH 7.2～7.5；所述完全培养基为包含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤具体包括：将所述第二细胞沉淀用样本稀释液重悬后，400～500g离心10～15min，弃上清；加入0.5～1.0mL 4℃预冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘丽，秦贵信，鲍男，赵元，刘佳伟，鄂天姣，赵进鹏，孙会，徐程宇，范夏蒲，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：