一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法，所述方法包括：将可传代培养的类器官消化成单个细胞；将所述单个细胞与含有5％～10％的基质胶的类器官培养基共混，获得含有细胞

【技术实现步骤摘要】
一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞和组织工程
，特别涉及一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法。

技术介绍

[0002]类器官是器官特异性细胞的集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与人体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建。简而言之，类器官是一种基于三维(Three
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dimensional，3D)体外细胞培养系统，可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间，细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。类器官能做到与人体内分化的组织具有相似的生理反应，与人体来源组织具有极高的相似性。与传统二维(Two
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dimensional，2D)细胞培养模式相比，类器官具有实质性的改进。类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间、细胞与基质间高度相互作用，形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景和商业价值。
[0003]目前，类器官的培养方法以基于Matrigel的基质胶滴法为主。其大致流程是将干细胞、干细胞分化的细胞及成体组织分散成小细胞团或者是单个细胞包裹在Matrigel中用特殊的培养基培养一段时候后得到类器官。目前，胶滴法培养类器官技术相对成熟，构建类器官的成功率达90％以上，适合于大多数类器官的培养。利用基质胶滴法得到的类器官表现出极大的异质性，例如类器官形成所用的时间差别较大、在最终形态上也具备较大的差异、类器官所具备的功能也在某些方面上无法保持一致，这严重影响了类器官培养的质量可控性。此外，在基质胶中培养的过程中，单个胶滴中含有多个类器官、类器官之间的相对位置随机，并且分布在不同焦平面，难以定位观察、个体差异化明显。上述局限性导致了类器官实验中难以进行定量，限制了类器官在基础研究和临床前药物开发的应用。
[0004]因此，有必要开发一种均一的单类器官模型，以用于基础研究和临床前药物开发中。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法，本专利技术培养的类器官具有高度的单一性，几乎可以确定每孔仅有一个类器官。本专利技术重复性高且操作可控性强等优势，对于普通实验室和批量生产均有较好的优势。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，所述方法包括：
[0008]将可传代培养的类器官消化成单个细胞；
[0009]将所述单个细胞与类器官培养基和体积比5％～10％的基质胶共混，获得共混物；
[0010]将所述共混物置于底部为疏水或超疏水的微孔板中，后离心以使细胞聚集于所述微孔板底部，再加入类器官培养基进行常规培养，获得基于微孔板的均一的单类器官模型。
[0011]进一步地，所述离心中，离心力为100g～400g，离心时间为3min～5min。
[0012]进一步地，所述微孔板为96孔板、384孔板和1536孔板中的一种。
[0013]进一步地，所述微孔板的底部为U形底或V形底。
[0014]进一步地，所述常规培养的时间为1～6d。
[0015]进一步地，所述可传代培养的类器官包括成体干细胞、正常组织、肿瘤组织来源的类器官。例如肝脏类器官、小肠类器官、胰腺相关类器官、胃类器官、肺类器官、乳腺类器官、肺癌类器官、结直肠癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、乳腺癌类器官、胰腺癌类器官、食管癌类器官、前列腺癌类器官、宫颈癌类器官等中的一种。
[0016]在本专利技术的第二方面，提供了所述方法制备得到的基于微孔板的均一的单类器官模型。
[0017]进一步地，所述微孔板中每个微孔仅含有一个类器官且在微孔的中心区域。
[0018]进一步地，所述基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法中单个类器官的大小为50μm～500μm。
[0019]进一步地，所述基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法中单个类器官的面积变异系数小于35％。
[0020]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0021]本专利技术的基于微孔板的均一的单类器官模型与已有的被广泛采用的经典的胶滴法培养类器官对比具有明显的优势，具体表现在：经典的胶滴法培养的类器官在最终形态、体积大小、形成位置上都具有显著的异质性；形成类器官并使其聚集的时间在1～2周不等；类器官培养都依赖于50％～100％浓度的基质胶如Matrigel胶，但由于所用高浓度基质胶黏度高，用离心等其他手段无法使细胞高度聚集。以上这些问题都是影响类器官标准化的障碍。而本专利技术利用类器官融合的和细胞自组织的技术手段，通过将低浓度的Matrigel胶融入到类器官培养液中，再进一步通过离心使Matrigel胶和细胞下沉到微孔板中心达到了使细胞聚集并且使聚集的细胞包埋在高浓度Matrigel胶中，从而创造了一种标准化的类器官模型及其制备方法，制备方法的相关参数已被确定，类器官形成位置、形态、大小都具有高度的均一性，各个孔间的类器官面积变异系数小于35％。本专利技术创造的模型及制作方法对比传统的胶滴法具有无可比拟的优势，解决了十年来类器官培养具有显著异质性的难题。具有的优点具体有：
[0022](1)本专利技术提供的一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法可以快速构建类器官，在短时间内培养出符合实验要求的产品。
[0023](2)本专利技术培养的类器官具有高度的单一性，几乎可以确定每孔仅有一个类器官。
[0024](3)本专利技术重复性高且操作可控性强等优势，对于普通实验室和批量生产均有较好的优势。
[0025](4)本专利技术可以大批量构建均一性的成体干细胞来源的类器官、肿瘤类器官、组织来源类器官。
[0026](5)本专利技术为类器官标准化提供了一个全新的解决方案，可极大地推动类器官在基础研究和临床转化研究中的应用，有望加速类器官质量标准化和市场化的发展。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0028]图1为均一性的单一类器官培养流程示意图及预期培养效果图；
[0029]图2为不同细胞数量对类器官生长的影响效果图；图2A为类器官培养开始时及第六天的明场图，标尺分别为500μm、100μm；图2B为类器官培养第六天的直径量化统计；图2C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计；
[0030]图3为不同Matrigel浓度对类器官生长的影响效果图；图3A为类器官培养开始时及第六天的明场图，标尺分别为500μm、10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将可传代培养的类器官消化成单细胞；将所述单细胞与含有体积比5％～10％基质胶的类器官培养基共混，获得共混物；将所述共混物置于底部为低粘附或超低粘附的微孔板中，然后离心以使细胞和Matrigel胶聚集于所述微孔板底部，再加入类器官培养基进行常规培养或分化培养，获得一种基于微孔板的均一性的单类器官模型。2.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，其特征在于，所述离心中，离心力为100g～400g，离心时间为3min～5min。3.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，其特征在于，所述微孔板为96孔板、384孔板和1536孔板中的一种。4.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，其特征在于，所述微孔板的底部为U形底或V形底。5.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法，其特征在于，所述得到单个类器官的常规培养的时间为1～6d。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈璞，金梦龙，江善青，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：