预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法技术

提供了用于用表达促血管生成因子的核酸构建体转导的血管细胞的预调节(preconditioning)、转导和/或低温保存的方法和组合物。还提供了这样的细胞在疗法中的用途。途。

【技术实现步骤摘要】
预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法
[0001]本申请要求美国临时专利申请第63/111,661号、第63/111,682号、第63/111,693号和第63/111,696号的优先权权益，所有这些申请均于2020年11月10日提交并且每一份申请通过引用以其整体并入本文。
[0002]序列表声明
[0003]在提交本申请时同时提交的标题为“89898 SequenceListing.txt”、创建于2021年11月8日、包含18,806字节的ACSII文件通过引用并入本文。
[0004]专利
和背景
[0005]本专利技术涉及化学、生物化学、细胞生物学、基因工程和医学领域。具体地，本专利技术涉及制备用于在使用前进行储存的转导的细胞的方法。具体地，本专利技术涉及预调节(preconditioning)血管细胞用于转导的方法、转导的方法、保存转导的细胞的方法以及保存的转导的细胞在临床中的用途。
[0006]外周动脉疾病(PAD)及其晚期、严重的肢体缺血影响着全球约2亿人。与下肢PAD相关的症状包括跛行，以及甚至更严重的表现，诸如静息痛(rest pain)、缺血性溃疡和组织损失。经皮血运重建术(percutaneous revascularization)或外科旁路术仅适用于具有生活方式受限的严重跛行的患者，然而在腹股沟韧带以下，经皮血运重建术受限于高再狭窄率，并且外科血运重建术受限于可能的移植失败和与血管手术相关的风险。因此，需要用于生活方式受限的跛行的替代治疗策略。
[0007]血管生成或侧枝重塑是一个复杂的过程，需要祖细胞、驻留内皮细胞(resident endothelial cells)、平滑肌细胞和生长因子(包括VEGF、FGF、胎盘生长因子和Ang
‑
1)的及时参与，它们可以通过许多步骤以协调的方式起作用，从而导致血管形成。理论上，这可以通过施用(重组)蛋白质、基因转移或细胞治疗(cell therapy)方法来实现。然而，系统性施用生长因子(例如，VEGF、bFGF)或相关转录因子(例如HIF
‑
1α)和通过基因转移局部表达单种生长因子的临床经验未能提供任何显著的治疗益处(Ouma等人，Vasc Med 2012，17:174
‑
92)。
[0008]血管生成细胞转移疗法不仅提供了自我补充的生长因子来源，而且通过血管细胞植入积极参与血管的发育和扩张。
[0009]另外的相关
技术介绍
：
[0010]Chae等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:2573
‑
78；
[0011]Ouma等人,Vasc Med 2012,17:174
‑
92；
[0012]Latchana等人,J Thorac Disease,2014；6:1143
‑
49；
[0013]美国专利申请20120015343；
[0014]Baust等人Adv Exp Med Biol 2016；951:13
‑
29；
[0015]美国专利第5,405,742号；
[0016]美国专利第5,514,536号；
[0017]美国专利第6,492,103号；
[0018]美国专利申请第20040053207号；
[0019]美国专利申请第20110177488号；
[0020]美国专利申请第20100105133号
[0021]美国专利申请第20160046685号；
[0022]美国专利申请第2003/0073237号；
[0023]美国专利申请第2009/0209630号；
[0024]WO2002/12539。
[0025]专利技术概述
[0026]根据本专利技术的一方面，提供了人类平滑肌(SM)细胞，所述人类平滑肌(SM)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF
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多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括使所述SM细胞与0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE
‑
葡聚糖接触，与用1.0mg/ml或更高的DEAE
‑
葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，所述SM细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
[0027]根据本专利技术的一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1中列出的多核苷酸序列。
[0028]根据本专利技术的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml
‑
0.5mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行并且进行1分钟和4分钟之间。
[0029]根据本专利技术的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行并且进行1分钟。
[0030]根据本专利技术的一些实施方案，接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。
[0031]根据本专利技术的一些实施方案，转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
[0032]根据本专利技术的一些实施方案，转导培养基是无血清培养基。
[0033]根据本专利技术的一些实施方案，人类平滑肌细胞选自由以下组成的组：新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞、冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞以及培养的人类平滑肌细胞。
[0034]根据本专利技术的一些实施方案，人类平滑肌细胞在转导之前和之后在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
‑
2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
[0035]根据本专利技术的一些实施方案，生长培养基还包含5％
‑
25％胎牛血清(FBS)。
[0036]根据本专利技术的一些实施方案，生长培养基还包含10％
‑
20％胎牛血清(FBS)。
[0037]根据本专利技术的一些实施方案，生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
[0038]根据本专利技术的一些实施方案，人类平滑肌细胞是在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
‑
2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中的从静脉组织分离的平滑肌细胞。
[0039]根据本专利技术的一方面，提供了人类内皮(EC)细胞，所述人类内皮(EC)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素
‑
1(Ang
‑
1)多肽的多核苷酸序列，其中预调节包括：
[0040](a)用包含内皮生长培养基(EGM)
TM
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2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基从静脉组织中分离所述EC细胞；
[0041](b)用包含内皮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人类平滑肌(SM)细胞，所述人类平滑肌(SM)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF
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多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括使所述SM细胞与0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE
‑
葡聚糖接触，与用1.0mg/ml或更高的DEAE
‑
葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，所述SM细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。2.根据权利要求1所述的人类平滑肌细胞，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1中列出的多核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的人类SM细胞，其中所述预调节用0.125mg/ml
‑
0.5mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行，并且进行1分钟和4分钟之间。4.根据权利要求1或2所述的人类SM细胞，其中所述预调节用0.125mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行并且进行1分钟。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的人类SM细胞，其中所述接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。6.根据权利要求4所述的人类SM细胞，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。7.根据权利要求5或6所述的人类SM细胞，其中所述转导培养基是无血清培养基。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞选自由以下组成的组：新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞、冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞以及培养的人类平滑肌细胞。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞在所述转导之前和之后被培养在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
‑
2 Bullet Kit培养基的培养基中。10.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含5％
‑
25％胎牛血清(FBS)。11.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含10％
‑
20％胎牛血清(FBS)。12.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。13.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞是在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
‑
2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中的从静脉组织分离的平滑肌细胞。14.人类内皮(EC)细胞，所述人类内皮(EC)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素
‑
1(Ang
‑
1)多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括：(a)用包含内皮生长培养基(EGM)
TM
‑
2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基从静脉组织中分离所述EC细胞；(b)用包含内皮生长培养基(EGM)
TM
‑
2 Bullet Kit培养基的EC培养基培养所述分离的EC细胞，以及(c)用1.0mg/ml DEAE
‑
葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，其中与(EGM)
TM
‑
2 Bullet Kit培养基相比，所述EC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述逆转录病毒构建体包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。16.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。17.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞在步骤(a)中在包含内皮生长培养基(EGM)
TM
‑
2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。18.根据权利要求14
‑
17中任一项所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞在步骤(b)中在包含内皮生长培养基(EGM)
TM
‑
2 Bullet Kit培养基和5％
‑
25％胎牛血清的生长培养基中培养。19.根据权利要求14
‑
18中任一项所述的EC细胞，其中步骤(b)的所述生长培养基还包含10％
‑
20％胎牛血清(FBS)。20.根据权利要求14
‑
16中任一项所述的EC细胞，其中所述生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。21.根据权利要求14
‑
20中任一项所述的EC细胞，其中所述接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。22.根据权利要求21所述的EC细胞，其中所述转导培养基还包含1mM
‑
10mM谷氨酰胺。23.根据权利要求21所述的EC细胞，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。24.根据权利要求21
‑
23中任一项所述的EC细胞，其中所述转导培养基是无血清培养基。25.一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF
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多肽的多核苷酸序列，所述方法包括：(a)用0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE
‑
葡聚糖预调节所述人类平滑肌细胞，以及(b)使人类平滑肌细胞与所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含所述核酸构建体的转导培养基中接触。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述预调节用0.125mg/ml
‑
0.5mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行。28.根据权利要求25所述的方法，其中所述预调节用0.125mg/ml DEAE
‑
葡聚糖进行。29.根据权利要求25
‑
28所述的方法，其中所述预调节进行1分钟和4分钟之间。30.根据权利要求25
‑
27所述的方法，其中所述预调节进行2分钟和3分钟之间。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述预调节进行1分钟。32.根据权利要求25
‑
30中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
‑
2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中分离。34.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞。
35.根据权利要求25
‑
31中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在转导之前被培养。36.根据权利要求25
‑
35中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述接触在1ml转导培养基的体积中进行。37.根据权利要求25
‑
36中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在所述转导之前和之后被培养在包含平滑肌生长培养基(SmGM)
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2 Bullet Kit培养基的培养基中。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述生长培养基还包含5％
‑
25％胎牛血清(FBS)。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％
‑
20％胎牛血清(FBS)。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。41.一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素
‑
1(Ang
‑
1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括：(a)用1.0mg/ml DEAE
‑
葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，以及(b)使所述人类内皮细胞与所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含所述核酸构建体的转导培养基中接触至少2.5个连续的小时且不超过3.5个连续的小时的持续时间。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。43.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.8
‑
3.2个连续的小时。44.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.5
‑
3.0个连续的小时。45.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.5个连续的小时。46.根据权利要求41
‑
45中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人类内皮细胞在包含内皮生长培养基(EGM)
TM
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2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。48.根据权利要求41
‑
45中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的内皮细胞。49.根据权利要求41
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48中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞在转导之前被培养。50.根据权利要求41
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49中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞在所述转导之前和之后在包含内皮生长(EGM)
TM
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2 Bullet Kit培养基的生长培养基中培养。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含5％
‑
25％胎牛血清(FBS)。52.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％
‑
20％胎牛血清(FBS)。53.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。54.根据权利要求41
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51中任一项所述的方法，其中所述转导培养基包含M199培养基。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含1mM
‑
10mM谷氨酰胺。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含2mM
‑
8mM谷氨酰胺。57.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。58.根据权利要求52
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57中任一项所述的方法，其中所述转导培养基是无血清培养基。59.一种低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF
165
多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在细胞内型低温保存溶液中孵育所述转导的人类平滑肌细胞。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。61.权利要求59或60所述的方法，其中所述细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液和能量底物。62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。64.根据权利要求59
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63中任一项所述的方法，其中所述低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐
‑
40、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。65.根据权利要求59所述的方法，其中所述低温保存溶液是FRS。66.根据权利要求59
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65中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。67.根据权利要求59
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【专利技术属性】
技术研发人员：摩西，
申请(专利权)人：维思尔治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：