一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。该细胞系名称为PMC

【技术实现步骤摘要】
一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。蚊子是乙型脑病毒的主要传播媒介。猪是乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源。猪乙型脑炎主要变现为怀孕母猪繁殖障碍，公猪睾丸炎。目前，我国用于预防猪乙脑感染的疫苗主要是经鼠脑组织培养制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞和Vero细胞制备的灭活疫苗。鼠脑组织和地鼠肾原代细胞制备的疫苗，在生产中存在实验动物来源紧张、生产成本高、产量低、外源因子多、批次差异大等缺点。Vero细胞制备的灭活疫苗解决了生产成本和稳定性问题，但是Vero细胞为非猪源细胞，存在外源因子污染的问题，对疫苗的品质存在一定的缺陷。基于地鼠肾原代细胞和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)对乙脑的病毒的生产应用，目前国内外尚未有猪源性肾细胞在乙脑病毒上的研究，为了克服现有技术的不足之处，寻找到一株适合乙脑病毒繁殖的猪源性肾细胞将为猪乙脑的防控带来积极的影响。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于弥补现有技术空白，建立一种自发永生化的猪原代肾小球系膜细胞系，并将其应用于猪乙型脑炎病毒的培养中，为猪乙型脑炎疫苗原代细胞生产方式提供技术储备。同时还可将该细胞系应用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0004]本专利技术提供的一种胎猪肾小球系膜细胞系，名称为PMC
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3，分类名称为胎猪肾小球系膜细胞，已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.23099。
[0005]胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3CGMCC No.23099通过下述方式得到：
[0006]剖腹取怀孕90日龄的胎猪，取出完整的肾脏置于PBS溶液中，将肾脏浸泡于酒精中消毒2min，然后转移至PBS溶液中清洗3次。小心剥离被膜血管等多余组织，将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质血管等中间白色组织。将剩余组织用眼科剪剪碎，加入1mlPBS后继续剪成碎块，用1ml断枪头转移至50ml离心管，然后用PBS反复清洗3次去除血细胞，至洗液澄清。将组织块少量多次转移至80目筛网，用注射器活塞塑料平端仔细研磨，边研磨边用PBS冲洗，将滤出液用100目网筛过滤。将过滤的液体转移至50ml离心管，1500r/min离心10min，弃上清，用0.05％～0.1％I型和0.05％～0.1％IV型胶原酶重悬肾小球，消化40min～1h。用100μm细胞筛网过滤消化液，然后1500r/min离心5min。弃上清，用细胞生长培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％双抗)重悬细胞，视细胞量铺T25细胞培养瓶，每瓶5ml培养液，置于培养箱中进行培养。在倒置显微镜下观察，细胞在24h即有少量贴壁，补加2ml培养液，贴壁培养48h
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72h增殖明显，进行换液培养。细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗三遍，加入
0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0007]此时获得的胎猪肾小球系膜细胞中含有一些肾小球内皮细胞。需通过细胞差速消化法对胎猪肾小球系膜细胞进行纯化，在细胞传代时，吸去培养液，PBS洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当大部分肾小球系膜细胞变圆脱落时，大概消化时间为2min，加入细胞生长培养基终止消化，离心后使用细胞生长培养基重悬细胞，换新的细胞培养瓶进行培养，如此反复三次，以去除肾小球内皮细胞，得到纯化的肾小球系膜细胞，然后通过单克隆方法对纯化的细胞进行再次纯化并挑选细胞生长状态好的胎猪肾小球系膜细胞进行继代培养。
[0008]当传代细胞传代超过60代时，获得自发永生化的胎猪肾小球细胞PMC
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3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23099。
[0009]本专利技术的效果：
[0010]本专利技术利用90日龄胎猪肾小球进行原代培养、纯化并连续传代，最终获得一株纯度高、能稳定传代的自发永生化胎猪肾小球系膜细胞系PMC
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3，该细胞系第60代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明连续传代后细胞没有发生染色体变异。该细胞系对猪乙型脑炎病毒高度易感，接毒后72h，细胞病变达到70％～80％，收获的病毒液病毒含量为10
7.5
PFU/ml，比Vero细胞培养的猪乙型脑炎病毒相比，具有收毒时间快、效价高的特点。同时该细胞系还可以用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养及流行性腹泻病毒的分离等，具有广泛的应用价值。
附图说明
[0011]图1是本专利技术实施例提供的纯化的胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3照片。A:第5代；B:第30代；C:第60代。
[0012]图2是本专利技术实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3间接免疫荧光鉴定示意图。A:Hoechst33342染核；B:抗波形蛋白抗体荧光标记；C:Merger
[0013]图3是本专利技术实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3核型分析结果染色体配对示意图。
[0014]图4是本专利技术实施例提供的胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3第60代细胞周期分布示意图。
[0015]图5是本专利技术实施例提供的乙型脑炎病毒(SA14
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14
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2株)在Vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3上的病变情况。A1:正常Vero细胞培养48h对照；A2:Vero细胞接乙型脑炎病毒后24h病变情况；A3:Vero细胞接乙型脑炎病毒后48h病变情况；A4:Ver细胞接乙型脑炎病毒后72h病变情况；A5:Vero细胞接乙型脑炎病毒后96h病变情况。B1:正常胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3培养48h对照；B2:胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3接乙型脑炎病毒后24h病变情况；B3:胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3接乙型脑炎病毒后48h病变情况；B4:胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3接乙型脑炎病毒后72h病变情况；B5:胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3接乙型脑炎病毒后96h病变情况。
[0016]图6是本专利技术实施例提供的猪瘟NS3多克隆抗体间接免疫荧光照片。A:猪瘟NS3多克隆抗体间接免疫荧光；B:正常细胞对照。
[0017]图7是本专利技术实施例提供的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞和胎猪肾小球系膜细胞PMC
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3上的病变情况。A1:正常Vero细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胎猪肾小球系膜细胞系，其特征在于：所述胎猪肾小球系膜细胞系，名称为PMC
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3，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23099。2.权利要求1所述的胎猪肾小球系膜细胞系在培养猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗树成，潘文，刘昕泽，潘春刚，吴冬荀，韩伟，肖进，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：