一种HEK293T细胞悬浮和无血清培养的快速驯化方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种HEK293T细胞的驯化方法及其应用，包括一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法、所述驯化方法获得的细胞系以及所述细胞系的应用。所述驯化方法传代次数少，驯化效率高，获得的细胞活率高，分散性好，生长状态稳定，可满足商业化、规模化生产的需求。求。求。

【技术实现步骤摘要】
一种HEK293T细胞悬浮和无血清培养的快速驯化方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种HEK293T细胞的驯化方法及其应用，具体涉及一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的快速驯化方法、以及所述驯化方法获得的细胞系及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]随着科学技术的发展，越来越多的基因治疗/细胞治疗技术从实验室走向临床，从学术走向商业化生产，2017年两款CAR
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T药物Kymriah和Yescarta被FDA批准上市，分别用于治疗治疗复发性或难治性儿童、青少年B
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细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)以及在接受至少两种其它治疗方案后无响应或复发性的成人大B细胞淋巴瘤患者及特定类型非霍奇金淋巴瘤患者。然而两款药物价格昂贵，分别为47.5万美元、37.3万美元。即使引入国内以后治疗费用也是居高不下，2020年2月14日，复星凯特提交的益基利仑赛注射液上市申请获得国家药监局受理，该药物复星凯特从Kite Pharma引进的Yescarta，定价为120万人民币，普通人仍然难以负担。同年国家药品监督管理局(NMPA)批准了药明巨诺靶向CD19的CAR
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T产品瑞基奥仑赛注射液(relma
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cel，商品名：倍诺达)的新药上市申请(NDA)，定价未知。
[0003]可见基因治疗/细胞治疗价格昂贵，想要惠及更多的人群，提高工艺水平、降低费用是关键。对于目前的基因/细胞治疗来说，病毒通常是首选的载体之一。目前病毒载体放大生产经历了四个发展阶段：从最开始实验室小规模生产常用的滚瓶培养
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细胞工厂
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固定床反应器培养
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悬浮培养技术，每一个新的培养方式都明显放大了病毒载体培养规模。目前固定床反应最大面积达到500m2，悬浮培养较为常规的体积达到2000L。悬浮培养技术也因为更高的流程优化潜力而更受药企关注。
[0004]HEK293细胞系作为常用的病毒生产载体具有如下特点：
[0005]1)转染效率高；
[0006]2)可悬浮培养；
[0007]3)表达蛋白结构最接近其在人体构象；
[0008]4)HEK293细胞在培养体系中能够快速增长，高密度培养；
[0009]5)HEK293细胞与神经元细胞一样。对外界环境较为敏感，利用这一点可用于药物发现及细胞毒性测试。
[0010]HEK293T细胞系是在HEK239细胞中转入SV40T
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antigen基因形成的高转衍生株。除了具有上述功能外，还可使包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。HEK293T细胞除了可用于各类基因表达以及蛋白生产，还常用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产。
[0011]HEK293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,目前的主要工艺是在细胞培养过程添加血清，细胞就血清中的贴壁因子而贴壁生长的，但是众所周知，使用血清带来各种弊端，如：价格昂贵，潜在的致病因子风险，难以规模化生产，生产工艺不可控等问题。
[0012]然而，经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，但是大多数经过悬浮驯化的细胞在悬浮培养过程中仍然会聚团，不利于质粒的转染进而影响病毒的产量。因此高效驯化无血清全悬浮培养型细胞株是解决上述问题的关键。

技术实现思路

[0013]针对以上技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0014]本专利技术的第一方面，提供一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法，所述驯化方法主要步骤为(1)：HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理，步骤(2)：在低浓度血清培养基中培养，获得HEK293TY细胞系。
[0015]优选的，所述多次处理步骤不超过3次，更优选为2次。
[0016]优选的，所述步骤(1)中，血清的起始浓度为8
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12％(体积)。
[0017]优选的，所述血清浓度递减的数值为3
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5％(体积)。每次递减的数值可以是3
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5％(体积)中的任一数值，例如3％，3.25％，3.5％，3.75％，4％，4.25％，4.5％，4.75％，5％等等。每次递减的数值可以相同或者不同。例如第一血清浓度为10％(体积)，第二血清浓度为5％(体积)，或者，又例如第一血清浓度为12％(体积)，第二血清浓度为7％(体积)，第三血清浓度为3.5％(体积)。又例如，第一血清浓度为8％(体积)，第二血清浓度为4％(体积)。
[0018]优选的，所述步骤(1)中的末次处理血清浓度不低于1％(体积)。
[0019]优选的，所述步骤(2)中低浓度血清中是指血清浓度小于1％(体积)，可以是小于1％的任意数值，例如，0.75％，0.5％，0.25％，0.15％，0.1％等等。
[0020]优选的，所述驯化方法的步骤(2)还包括对贴壁细胞洗脱吹散的步骤。
[0021]优选的，所述驯化方法还包括步骤(3)：对步骤(2)获得的HEK293TY细胞系在无血清培养基中扩大培养。
[0022]更优选的，步骤(3)包括以无血清培养基中对细胞系进行重复培养。
[0023]进一步优选的，所述重复培养至少2次。更优选的，可以是3次、4次、5次，等等。
[0024]优选的，所述重复培养后获得的活细胞密度大于2.5
×
106个/ml。
[0025]在一个进一步的实施方案中，所述的驯化方法，包括步骤(1)、HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理：
[0026]a、复苏HEK293T细胞，在包含第一浓度血清的培养液中处理HEK293T细胞；所述处理包括例如混匀等；
[0027]b、离心，弃上清；
[0028]c、在包含第二浓度血清的培养液中处理步骤b所得沉淀，所述处理包括例如混匀，静置。
[0029]其中，所述第一浓度血清和第二浓度血清根据上述限定依次进行浓度递减。
[0030]优选的，所述步骤c之后，可选的，将HEK293T细胞在包括第三浓度血清的培养液中处理。
[0031]优选的，所述步骤(2)包括：
[0032]d、将步骤c获得的细胞在包含低浓度血清的培养基中培养；
[0033]e、将步骤d获得的悬浮细胞移至离心管；
[0034]f、将步骤d获得的贴壁细胞洗脱吹散后移至步骤e相同的离心管。
[0035]更优选的，步骤(2)还包括：
[0036]g、将步骤f获得的细胞，离心，弃上清，在无血清培养基中进行培养。
[0037]优选的，上述培养液或者培养基选自：DMEM培养基、VP
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SFM培养基。
[0038]优选的，所述驯化方法还包括步骤(3)：对步骤(2)获得的HEK293TY细胞系进行无血清培养基增殖培养，其包括：
[0039]h、将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法，其特征在于，所述驯化方法包括步骤(1)：HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理，步骤(2)：在低浓度血清培养基中培养，获得HEK293TY细胞系。2.如权利要求1所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，血清的起始浓度为8
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12％(体积)。3.如权利要求1
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2任一所述的驯化方法，其特征在于，所述血清浓度递减的数值为3
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5％(体积)。4.如权利要求1
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3任一所述的驯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中低浓度血清是指血清浓度小于1％(体积)。5.如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，张玥，张华，
申请(专利权)人：宜明苏州细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：