一种检测制造技术

本发明专利技术提供一种检测

【技术实现步骤摘要】
一种检测HEK293细胞残留DNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种
qPCR
扩增法测量
HEK293
细胞残留
DNA
的方法，以及相应的引物和探针
。

技术介绍

[0002]HEK293
细胞即人胚胎肾细胞
293(ATCC CRL
‑
1573)
，其具有转染效率高
、
可悬浮培养的特点，且
HEK293
细胞在培养体系中能够快速增长，实现高密度培养用于大规模表达，因此被广泛的用于生产蛋白
、
疫苗
、
抗癌试剂及重组腺病毒包被等
。
宿主细胞残留
DNA
是指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的
DNA
片段
。
用传代细胞株生产的生物制品，其宿主细胞残留
DNA
可能会传递肿瘤或病毒相关基因，存在潜在的危险性
。
由于残余
DNA
的潜在致病风险性，各国药品监督管理机构对宿主细胞
DNA
的残留量有着严格的限度控制，同时各国药典也提供数种经典的检测方法
。WHO
和欧盟规定每人份的生物制剂产品中
DNA
的残留量需控制在
10ng
以下；美国
FDA
则规定每人份生物制剂产品中
DNA
的残留量在
100pg<br/>以内
。
[0003]建立合适的宿主细胞残留
DNA
检测方法有助于监测生产工艺，确保生物制品的安全性和质量
。
目前以实时定量聚合酶链式反应
(qPCR)
方法为最优
。qPCR
法是具有序列特异性以及高灵敏度等优点的检测方法，它通过同时加入一对引物和探针，在
PCR
扩增时产物的增加可以通过荧光信号的强弱指示，最后通过实时监控体系中的荧光信号强弱，可以对样本进行定量分析
。
现在
qPCR
法因其高特异性
、
高灵敏度等特点而得到广泛的应用
。
[0004]通过
qPCR
法检测
HEK293
细胞内残留的
DNA
已经有了部分报道，如
CN115747344
公开了一种
qPCR
法
HEK293
细胞残留
DNA
检测试剂盒，以上提到的文献以全文引入本申请
。
基于研发人员更高的需求，如何设计出一种更精确
、
检测下限更低的
DNA
残留的检测方法，仍然是本领域亟待解决的问题
。

技术实现思路

[0005]在一方面，本专利技术提供一种
qPCR
扩增法测量
HEK293
细胞残留
DNA
的方法，其特征在于，所述
qPCR
扩增所用特异性引物及探针如下所示：
HEK293 qPCR 上游引物：
5'
‑
CGGGTTCACGCCATTCTCC
‑
3' (SEQ ID NO
：
1)
；
HEK293 qPCR
下游引物：
5'
‑
TAAAAATTAGCCGGGCGTAGTGG
‑
3' (SEQ ID NO
：
2)
；以及
HEK293 qPCR
探针：
5'
‑
TGCCTCAGCCTCCCGAGT
ꢀ‑
3' (SEQ ID NO
：
7)。
[0006]引物的设计位置为人源
RP11
‑
279F15
序列位置
。
人源
RP11
‑
279F15
位于人
13
号染色体，设计引物扩增的片段大小为
81bp
，具体序列如下所示：
CGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTGCAGGCGCTCACCACTACGCCCGGCTAATTTTTA (SEQ ID NO
：
8)。
[0007]进一步地，
DNAprobe
为包括荧光基团和荧光淬灭基团的单链
DNA
探针，荧光基团为
FAM
，荧光淬灭基团为
BHQ1。
[0008]进一步地，还包括样品的前置处理，样品处理为一种基于磁珠的样本前置处理
。
[0009]进一步地，
qPCR
扩增的反应体系中的上游引物的浓度为
10
μ
M
，下游引物的浓度为
10
μ
M
，探针的浓度为
10
μ
M。
[0010]在一些实施方式中，
qPCR
扩增的反应体系中的上游引物的浓度为
10
μ
M
；在一些实施方式中，下游引物的浓度为
10
μ
M
；在一些实施方式中，探针的浓度为
10
μ
M。
[0011]进一步地，
qPCR
扩增的反应体系为
20
μ
l
，其组成为：
qPCRMIX10
μ
l
，上游引物
0.4
μ
l
，下游引物
0.4
μ
l
，探针
0.2
μ
l
，
DNA5
μ
l
，
ddH2O4
μ
l。
[0012]在一些实施方式中，
qPCRMIX
为
ACeQUniversalU+ProbeMasterMixV2
，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司
。
[0013]进一步地，
qPCR
扩增的反应程序为
37℃
恒温
2min
，
95℃
预变性
5min
，然后
95℃10sec
，
60℃30sec
，
40
个循环
。
[0014]在另一方面，本申请还提供一种
qPCR
扩增法检测
HEK293
细胞残留
DNA
的试剂盒，试剂盒包括如下所示
q本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
qPCR
扩增法测量样品中
HEK293
细胞残留
DNA
的方法，其特征在于，所述
qPCR
扩增所用特异性引物及探针如下所示：
HEK293 qPCR 上游引物：
5'
‑
CGGGTTCACGCCATTCTCC
‑
3'
；
HEK293 qPCR
下游引物：
5'
‑
TAAAAATTAGCCGGGCGTAGTGG
‑
3'
；以及
HEK293 qPCR
探针：
5'
‑
TGCCTCAGCCTCCCGAGT
ꢀ‑
3'。2.
根据权利要求1所述的方法，其中，所述探针为包括荧光基团和荧光淬灭基团的单链
DNA
探针，所述荧光基团为
FAM
，所述荧光淬灭基团为
BHQ1。3.
根据权利要求1所述的方法，还包括在所述测量前采用磁珠法提取所述样品中的
DNA。4.
根据权利要求1所述的方法，其中，所述
qPCR
扩增法的反应体系中的所述上游引物的浓度为
10 μ
M
，所述下游引物的浓度为
10 μ
M
，所述探针的浓度为
10 μ
M。5.
根据权利要求4所述的方法，其中，所述
qPCR
扩增法的反应体系为
20 μ
l
，其组成为：
qPCR MIX 10 μ
l
，上游引物 0.4 μ
l
，下游引物 0.4 μ
l
，探针 0.2 μ
l
，
DNA 5 μ
l
，
ddH2O 4 μ
l。6.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，王志民，蒋辉，肖英杰，郑荣会，
申请(专利权)人：宜明苏州细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：