一种评价亚硫酸氢盐处理制造技术

本发明专利技术公开了一种评价亚硫酸氢盐处理

【技术实现步骤摘要】
一种评价亚硫酸氢盐处理DNA样品转化效率及核酸回收率的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种评价亚硫酸氢盐处理
DNA
样品转化效率及核酸回收率的方法
。

技术介绍

[0002]DNA
甲基化是
DNA
上化学修饰中的一种形式，它能够在不改变
DNA
序列的前提下，使得遗传表型发生变化
。DNA
甲基化的过程指在
DNA
甲基转移酶
(DNMTs)
的催化作用下，以
S
‑
腺苷甲硫氨酸
(SAM)
作为甲基供体，将基因组
DNA
上胞嘧啶
(C)
的5号位碳原子加上一个甲基变成5‑
甲基胞嘧啶
(5mC)。DNA
甲基化是表观遗传学中研究较为深入的一种形式，它在细胞内具有多方面的生物学意义
。DNA
甲基化可以作为一个分子开关来控制转录，从而实现对基因表达的调控
。
众多研究表明，
DNA
甲基化与细胞分化
、
胚胎发育
、
基因组印记及
X
染色体失活等众多生物学事件密切相关，并参与癌症等疾病的发生与发展过程
。
[0003]鉴于
DNA
甲基化的重要功能，研究人员开发出了许多特异性检测
DNA
甲基化位点的方法和技术
。5
‑r/>甲基胞嘧啶
(5mC)
与非甲基化的胞嘧啶
(C)
仅存在一个甲基的差异，但这并不影响二者与鸟嘌呤
(G)
进行正常的碱基配对，所以常规的测序技术或依靠
DNA
链杂交互补的检测方法无法直接实现对
5mC
的检测
。
目前，绝大多数的甲基化检测技术都基于亚硫酸氢盐处理
(Bisulfite Conversion)
转化
DNA
的原理，即：在亚硫酸氢盐溶液中，
DNA
上正常的胞嘧啶
(C)
脱氨基被转变成尿嘧啶
(U)
，而甲基化的胞嘧啶
(5mC)
则保持不变，这样原始
DNA
序列中本来无法进行区分的
5mC
与
C
碱基就可以通过上述化学处理产生碱基配对性质的变化；由于尿嘧啶与胸腺嘧啶
(T)
的结构相似，这些位点后续在芯片杂交
、
测序及
PCR
反应中会被识别为
T
，而发生甲基化的胞嘧啶位点仍会被识别为
C
，这样就实现了对
DNA
序列上5‑
甲基胞嘧啶的精准检测
。
基于亚硫酸氢盐转化技术的原理，人们开发了甲基化特异性
PCR(MSP)、
定量甲基化特异性
PCR(qMSP)、
甲基化敏感性高分辨率熔解技术
(MS
‑
HRM)、
靶向亚硫酸氢盐测序
(Targeted bisulfite sequencing)、
简并代表性亚硫酸氢盐测序
(RRBS)
及全基因组亚硫酸氢盐测序
(WGBS)
等技术，使得特定基因或者全基因组甲基化水平的检测及研究成为现实
。
[0004]迄今为止，基于亚硫酸氢盐转化来检测5‑
甲基胞嘧啶
(5mC)
的方法已经被广泛应用到表观遗传学研究及肿瘤诊断相关的临床方向
。
在使用亚硫酸氢盐处理
DNA
样本的过程中，有两个关键的技术指标会影响下游的甲基化检测实验，即转化效率和
DNA
回收率
。
转化效率就是转化后
DNA
样本中胞嘧啶转变为尿嘧啶的比例，它决定了后续甲基化位点检测的准确性；亚硫酸氢盐转化要求序列中所有的胞嘧啶
(C)
彻底或接近全部地转变为尿嘧啶
(U)
，如果转化不完全就会造成假阳性结果
。DNA
回收率是指亚硫酸氢盐处理后获得的
DNA
量占起始投入
DNA
样本量的比例，这将直接影响下游甲基化检测的灵敏度，合理评估
DNA
回收率对于
cfDNA
等小量珍贵样本的甲基化研究尤其重要
。
众多文献结果表明，亚硫酸氢盐处理流程会造成
DNA
链的降解，如果在这一过程中对核酸的保护不充分将会导致转化后有效
DNA
模板的减少，最终使得甲基化检测结果产生假阴性
。
考虑到亚硫酸氢盐处理对转化时间
、
温度
、
核酸保护剂及转化试剂浓度等要求较为苛刻，在使用商业化转化试剂或实施转化试剂研究开发的同时，需要重点对转化效率及回收率这两个指标进行系统评估，以保证其能够适配下游的甲基化检测实验，使得最终的结果更加稳健
、
精准
。
[0005]然而，针对亚硫酸氢盐处理流程中
DNA
转化效率及回收率的评估，相关的方法或技术开发仍较为滞后
。
刘洋洋等
(《
遗传
》
，
2015,37(9):6)
报道了一种
DNA
甲基化分析中重亚硫酸盐处理
DNA
转化效率的评估技术，使用内参基因
β
‑
actin
的序列片段分别设计针对转化前后模板的特异性引物探针，最终通过绘制两条标准曲线以绝对定量的方式计算待测
DNA
样本的转化效率；类似地，申请号为
202211114282.9
的专利技术专利通过常规引物设计，利用
Sybr Green
染料法来检测人源核酸样本中
GNAS、GPR1、PAX6
和
Actin
共4个基因甲基化及未甲基化的
Δ
Ct
值，依靠公式来计算待测样本的转化效率
。
这两种方法的操作均存在一定的繁琐性，且仅适用于人源
DNA
样本，无法直接应用于其他物种
。
除此之外，申请号为
CN201610015862.0
的专利技术专利公开了使用2种外源核酸标准品及标准曲线以绝对定量的方式来实现对亚硫酸氢盐转化效率的评估，但该方法操作费时，需对拷贝数进行较为复杂地计算，且依靠
Sybr Green
试剂定量容易受到非特异性扩增的影响
。
申请号为
201710941702.3
的专利技术专利提供了一种检测亚硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种评价亚硫酸氢盐处理
DNA
样品转化效率及核酸回收率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)
设计并合成一条外源且无甲基化的标准品
DNA
，以及设计并合成针对标准品
DNA
及其亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量
PCR
扩增的引物探针组；
(b)
向
DNA
样品中加入标准品
DNA
，得到
DNA
混合物，采用引物探针组对
DNA
混合物中标准品
DNA
模板进行荧光定量
PCR
扩增，得到
Ct
值，记为
Ct1；
(c)
对
DNA
混合物进行亚硫酸氢盐转化处理，纯化后得到
bisDNA
，再采用引物探针组对
bisDNA
中标准品
DNA
转化后的模板及未发生转化的模板分别进行荧光定量
PCR
扩增，得到
Ct
值，分别记为
Ct2和
Ct3；
(d)
按照分别计算亚硫酸氢盐处理
DNA
样品的转化效率和核酸回收率
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤
(a)
中，标准
DNA
序列如
SEQ ID NO
：1所示
。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤
(a)
中，针对标准品
DNA
进行荧光定量
PCR
扩增的引物探针组选自引物探针组
1、
引物探针组2和引物探针组3中的一种；所述引物探针组1中上游引物的序列如
SEQ ID NO
：2所示，下游引物的序列如
SEQ ID NO
：3所示，探针引物的序列如
SEQ ID NO
：4所示；所述引物探针组2中上游引物的序列如
SEQ ID NO
：5所示，所述下游引物的序列如
SEQ ID NO
：6所示，所述探针引物的序列如
SEQ ID NO
：7所示；所述引物探针组3中上游引物的序列如
SEQ ID NO
：8所示，所述下游引物的序列如
SEQ ID NO
：9所示，所述探针引物的序列如
SEQ ID NO
：
10
所示
。4.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤
(a)
中，针对标准品
DNA
的亚硫酸氢盐转化后序列进行荧光定量
PCR
扩增的引物探针组选自引物探针组
4、
引物探针组5和引物探...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘梦豪，马刘敏，孟浩巍，
申请(专利权)人：广州百因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：