一种Human残留总RNA检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种Human残留总RNA检测试剂盒及其检测方法和应用，所述试剂盒包括：Human RNA定量标准品、RNA IPC Primer

【技术实现步骤摘要】
一种Human残留总RNA检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种Human残留总RNA检测试剂盒及其检测方法和应用。

技术介绍

[0002]以质粒/minicircle DNA为代表的DNA产品可以作为DNA疫苗产品或产品的主要成分之一，也可作为病毒载体或DNA载体基因疗法的重要原料，病毒载体或非病毒载体细胞免疫疗法的重要原料。在细胞药生产过程中，经常需要用到293T细胞，这些DNA产品的RNA残留可能影响其生物学活性(如干扰质粒的转染、表达效率等)或造成风险(如由外源RNA激活细胞干扰素通路而引发的免疫反应)，因此需建立DNA产品的RNA残留定量检测方法。
[0003]qPCR反应目前在生物
应用十分广泛：不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于临床上疾病的诊断、药物疗效考核、肿瘤基因检测等，qPCR技术可以用于任何DNA、RNA相关的检测。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。
[0004]中国专利CN115466781A公开了一种Human DNA残留检测试剂盒及其检测方法和应用，通过在常规PCR基础上加入特定荧光标记引物探针制备得到Human DNA残留检测试剂盒，实现了对Human残留DNA的定量分析。该试剂盒的扩增效率高，特异性强，精确度、灵敏度高，可重现性好，具有优异的冻融稳定性。然而其对RNA无法实现检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个方面提供了一种Human残留总RNA检测试剂盒，所述试剂盒包括：Human RNA定量标准品、RNA IPC Primer&Probe Mix、Human RNA Primer&Probe Mix、One Step Enzyme Mix。
[0006]在一些实施方式中，所述RNA IPC Primer&Probe Mix包括质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板，质控IPC上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，质控IPC下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，质控IPC探针序列如SEQ ID NO.3所示，质控RNA模板序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]质控IPC上游引物：TTACATGCACGAGGCCCTTAC
[0008]质控IPC下游引物：TTCCTTAGCACTGCCCTGAC
[0009]质控IPC探针：Vic
‑
TTCACCCGTAGGGAGCGTCACC
‑
BHQ1
[0010]质控RNA模板：
[0011]ATCATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACTAGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATACAGGGTGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGTGGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGCC
[0012]在一些实施方式中，所述质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板的体积比为0.6：0.6：0.4：5。
[0013]在一些实施方式中，所述Human RNA Primer&Probe Mix包括靶标RNA的上游引物、
下游引物和探针，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，探针序列如SEQ ID NO.7所示。
[0014]上游引物：CGGCATCAGAGACCTGAT
[0015]下游引物：CGCGTCCGCCAACTTCTAA
[0016]探针：FAM
‑
CATTCTCGGGTAGCTGAACGCCACCT
‑
BHQ1
[0017]进一步地，所述靶标RNA的上游引物、下游引物和探针的体积比为3:3:2。
[0018]在一些实施方式中，所述One Step Enzyme Mix包括逆转录酶、PCRbuffer、dNTPs、Mg
2+
，购买自赛默飞。
[0019]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：One Step RT
‑
qPCR buffer、RNA稀释液、ROX Low、ROX High。
[0020]本专利技术的第二个方面提供了一种采用所述的试剂盒检测Human残留总RNA的方法，所述方法包括如下步骤：
[0021]S1.Human RNA定量标准品的稀释；
[0022]S2.qPCR反应液的制备和加样；
[0023]S3.qPCR程序参数设置；
[0024]S4.qPCR结果分析。
[0025]在一些实施方式中，所述S1中稀释具体包括：取6支1.5mL离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，在STD0管中用RNA稀释液将E.coli RNA定量标准品稀释10倍，振荡混匀后短时间快速离心10s，在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5管中分别加入5μL稀释后的STD0和45μLRNA稀释液。
[0026]在一些实施方式中，所述STD0管中RNA稀释液的浓度为200pg/μL，所述STD1管中RNA稀释液的浓度为20pg/μL，所述STD2管中RNA稀释液的浓度为2pg/μL，所述STD3管中RNA稀释液的浓度为0.2pg/μL，所述STD4管中RNA稀释液的浓度为0.02pg/μL，所述STD5管中RNA稀释液的浓度为0.002pg/μL。
[0027]在一些实施方式中，所述S2中qPCR反应液的制备和加样进一步根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数进行实验用的各试剂需要的量进行制备及加样。
[0028]在一些实施方式中，所述S3中qPCR程序参数设置进一步按照说明书对qPCR设备进行程序设定。
[0029]在一些实施方式中，所述qPCR程序参数设置具体包括以下步骤：
[0030]S1、创建实验反应程序，设置PCR反应程序如下：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环，反应体积20μL；
[0031]S2、创建实验反应板，点击SelectFluorophores选择荧光FAM；(a)在反应板图表中，选择样品孔，在SampleType中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，TargetName进行命名，输入每个样品的重复次数及SampleName；(b)在反应板图表中，选择标曲孔，在SampleType中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，TargetName命名E.coli
‑
RNA，输入每个稀释梯度的重复次数及SampleName；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5的Concentration一栏进行赋值，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：Human RNA定量标准品、RNA IPC Primer&Probe Mix、Human RNA Primer&Probe Mix、One Step Enzyme Mix。2.根据权利要求1所述的Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述RNAIPC Primer&Probe Mix包括质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板，质控IPC上游引物序列如SEQIDNO.1所示，质控IPC下游引物序列如SEQIDNO.2所示，质控IPC探针序列如SEQIDNO.3所示，质控RNA模板序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求2所述的Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板的体积比为0.6：0.6：0.4：5。4.根据权利要求3所述的Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述Human RNAPrimer&Probe Mix包括靶标RNA的上游引物、下游引物和探针，上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示，探针序列如SEQIDNO.7所示。5.根据权利要求1所述的Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述One Step Enzyme Mix包括逆转录酶、PCRbuffer、dNTPs、Mg
2+
。6.根据权利要求1所述的Human残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：One Step RT
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qPCR buffer、RNA稀释液、ROX Low、ROX High。7.一种采用权利要求1
‑
6任一项所述的试剂盒检测Human残留总RNA的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：许金超，栗红建，张丹，李永锋，刘丽美，张伟男，蔡宇卿，郭彬彬，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：