【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学诊断领域，特别是涉及一种检测2019-ncov的crispr试剂及其在制备检测2019-ncov的试剂盒中的用途等。
技术介绍
1、冠状病毒是一个大型rna病毒家族
2、 而现有技术中，核酸检测试剂盒通常为荧光定量pcr检测与测序检测方法。然而，这些技术仍具有诸多不足之处：1.pcr技术需要精确的温度系统控制，在一些不发达地区无法实现；2.检测灵敏度和特异性仍需进一步提高；3.pcr技术只能用于dna片段检测，rna片段需要提前加入一步逆转录的过程，操作复杂，而且开管操作容易造成样品污染。可见，这些检测方法对实验仪器，检测人员，检测场所有限制。
3、聚合酶扩增(rpa)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和具有链置换功能的dna聚合酶，在恒定温度下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量pcr(qpcr)检测方式，其并没有实质性的灵敏度提升。
4、cas蛋白是来源于古菌和细菌的利用crispr-cas系统抵御外源dna浸染的蛋白，包括cas9，cpf1，c2c1，c2c2(cas13a)等，它们都是由向导rna介导的切割目标dna的dna核酸内切酶。cas9和cpf1已成功开发为重要的基因编辑工具，它们可作为开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的巧妙工具。cas13a是vi型crispr-cas系统效应蛋白，具有rna介导的rna酶切活性，是目前第
技术实现思路
1、本专利技术发现，基于crispr分子诊断技术，通过rpa-crispr的偶联，能够实现“序列扩增”(rpa完成)加上“酶促级联”(cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019-ncov进行检测。因此，
2、本专利技术提供一种检测2019-ncov的crispr试剂，其中，所述crispr试剂包括rpa扩增引物对及对应的crrna。
3、优选的，所述crrna包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为rpa扩增引物对的扩增序列。
4、优选的，所述引物对扩增2019-ncov的核酸序列。更优选的，所述2019-ncov的核酸序列包括核酸蛋白n和/或棘突糖蛋白s的转录核酸。更优选的，所述2019新型冠状病毒核酸蛋白n的转录核酸序列如seq id no：3或6所示，和/或所述棘突糖蛋白s的转录核酸序列如seq id no：9、12或15任意一个或者多个所示。
5、优选的，所述引物对包含seq id no：1和2；seq id no：4和5，seq id no,7和8；seqid no：10和11；或者seq id no：13和14任意引物对，更优选的，所述引物对如seq id no：1和2；seq id no：4和5，seq id no,7和8；seq id no：10和11；或者seq idno：13和14任意一对或多对引物对所示。
6、优选的，所述锚定序列与cas蛋白特异性识别。更为优选的，所述锚定序列包含富含尿嘧啶的茎环结构。
7、优选的，所述锚定序列如seq id no：21、47和48任意所示。
8、优选的，所述cas蛋白为cas13a蛋白，cas13a蛋白可以来自不同细菌，包括leptotrichia shahii(lshcas13a)，leptotrichia buccalis(lbucas13a)，leptotrichiawadei(lwcas13a)等。更为优选的，所述cas13a蛋白为lwcas13a或lbucas13a。
9、cas13a的激活需要锚定序列、向导序列、靶序列的共同参与，即，当向导序列靶向到rna目标时，与至少20个碱基的crrna的锚定序列共同作用，通过富含尿嘧啶的茎环结构与cas13a分子相互作用，并通过cas13a的一系列构象变化转入一种酶促激活状态。而cas13a蛋白一旦激活，它将结合并切割其他的rna，而不管它们是否与crrna的靶向序列同源。这一点与其他cas蛋白截然不同，这也是选择cas13a作为该功能蛋白的原因。
10、优选的，所述向导序列为核酸蛋白n或者棘突糖蛋白s相匹配的序列，优选的，向导序列为核酸蛋白n相匹配的序列，更优选的，所述向导序列匹配的靶向序列包括seq id no：3、6、9、12和/或15任意一个或者多个序列。
11、优选的，所述向导序列如seq id no：22-26任意序列所示。
12、优选的，所述crrna为上述锚定序列和上述向导序列任意的组合，例如seq id no：21与seq id no：22-26任意序列的组合；seq id no：47与seq id no：22-26任意序列的组合；seq id no：48与seq id no：22-26任意序列的组合。
13、更为优选的，所述crrna序列如seq id no：16-20的任意序列中所示，进一步优选的，所述crrna序列如seq id no：17中所示。
14、优选的，所述crispr试剂还包括rna报告探针，所述rna报告探针为随机单链rna分子，一端带有一个荧光素基团，一端带有生物素基团。优选的，所述rna报告探针为polyu，更优选的，一端以生物素biotin标记，一端以fam标记。进一步优选的，所述rna报告探针如fam-uuuuuuuuuuuuuu-bio所示。
15、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：1和2所示的rpa扩增引物对和如seq id no：16所示的crrna。
16、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：4和5所示的rpa扩增引物对和如seq id no：17所示的crrna。
17、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：7和8所示的rpa扩增引物对和如seq id no:18所示的crrna。
18、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：10和11所示的rpa扩增引物对和如seq id no:19所示的crrna。
19、在一个具体实施方式中，所述crispr试剂包括如seq id no：13和14所示的rpa扩增引物对和如seq id no:本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测2019-nCov的CRISPR试剂，其特征在于，所述CRISPR试剂包括RPA扩增引物对及对应的crRNA，其中，所述RPA扩增引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列的N7引物对，所述对应的crRNA为SEQ ID No：17所示序列。
2.如权利要求1所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为RPA扩增引物对的扩增序列。
3.如权利要求2所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述锚定序列与Cas13a蛋白特异性识别。
4.如权利要求1所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述CRISPR试剂还包括RNA报告探针。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的CRISPR试剂在制备检测2019-nCov的试剂盒中的用途。
6.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的CRISPR试剂。
7.一种非诊断治疗目的的利用权利要求1-4任一项所述的CRISPR试剂
...【技术特征摘要】
1.一种检测2019-ncov的crispr试剂，其特征在于，所述crispr试剂包括rpa扩增引物对及对应的crrna，其中，所述rpa扩增引物对为seq id no：4和seq id no：5所示序列的n7引物对，所述对应的crrna为seq id no：17所示序列。
2.如权利要求1所述的crispr试剂，其特征在于，所述crrna包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为rpa扩增引物对的扩增序列。
3.如权利要求2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，郭学双，崔若茗，
申请(专利权)人：宜明苏州细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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