一种非酒精性脂肪性肝病肝脂肪变性模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种非酒精性脂肪性肝病肝脂肪变性模型的构建方法及其应用，所述构建方法包含以下步骤：将原代肝细胞贴附培养；将肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞消化后离心并弃去上清；将肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞接种至肝细胞中诱导培养。在共培养诱导体系下，可以使肝细胞脂滴形成并逐渐增多融合形成大脂滴呈现脂肪沉积。肝细胞脂肪沉积的形成可作为肝脂肪变性模型。本发明专利技术构建的模型诱导周期短，成本更加低廉且更接近于临床疾病特征；相比于单纯原代肝细胞培养及3D微球培养模式，本发明专利技术方法肝细胞体外培养持续时间较长，模型稳定、成型率高、重复性好且无需生物材料的协助。重复性好且无需生物材料的协助。

【技术实现步骤摘要】
一种非酒精性脂肪性肝病肝脂肪变性模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种非酒精性脂肪性肝病肝脂肪变性模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪性肝病(non
‑
alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，其病理进程包括有脂肪变性，非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎及后期地肝硬化及肝细胞肝癌等。当前，虽然已有大量的研究阐述了NAFLD的发病、发展机制，并筛选制定了一定、有效的治疗手段，但目前针对该疾病的具体分子作用机制仍未完全阐明，且尚未有批准针对该类疾病的特效药物，因此针对NAFLD疾病过程及机制需进一步深入研究。而脂肪变性作为 NAFLD疾病早期地进展阶段及病理特征，能够贯穿与NAFLD疾病的每个阶段，对于其早发现、早干预能够有效地逆转NAFLD疾病向非酒精性脂肪性肝炎及肝硬化和肝癌等恶性阶段进展。因此，深入研究阐明NAFLD脂肪变性阶段疾病发生发展分子机制，从中发现并筛选有效地治疗靶点，能够从早期阶段有效地避免NAFLD的进展及恶化。而为了充分、有效地研究NAFLD肝脂肪变性，肝脂肪变性模型的构建成为了阐明该疾病发生及进展机制的有效手段。
[0003]而当前对于肝脂肪变性模型的构建主要包括以下几类：
[0004]1.动物基因构建鼠和/或饮食诱导模型，该类模型通过构建ob/ob(瘦素蛋白基因缺陷)、 db/db(瘦素蛋白受体基因缺陷)或Foz/Foz(Alms1基因突变或缺陷)鼠，诱导形成具有肥胖，胰岛素抵抗及脂肪变性特征，并经再次高脂、高糖、高胆固醇及蛋氨酸和胆碱缺乏等饮食诱导形成的NAFLD或NASH模型。基因构建鼠如ob/ob和db/db鼠，虽能在表型上构建出NAFLD的脂肪变性特征，但在NAFLD或NASH病人的检测结果中显示，该类疾病与瘦素蛋白基因的突变或缺陷相关性较弱，因此通过突变或缺陷基因构建的模型与临床NAFLD 和NASH疾病机制不匹配；而高脂、高糖、高胆固醇及蛋氨酸和胆碱缺乏等不同饮食诱导的模型中同样在代谢功能，基因表达及疾病表征等方面与临床NAFLD和NASH疾病存在差异，因此用于疾病过程和机制的研究不具有特异性。
[0005]2.体外二维或三维培养构建模型，利用原代肝细胞或永生化肝细胞系如HepG2、Huh
‑
7 和AML
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12等细胞在二维体系或三维微粒体系构建NAFLD模型，表征为脂肪变性及炎症表达等。虽然体外的这些模型能够构建出肝组织的复杂结构并能通过细胞间相互作用阐明脂肪肝病疾病进程的分子机制。但单纯的原代细胞在体外难以维持较长时间的培养，且在体外培养过程中原代肝细胞会随着培养时间的延长，细胞组织特异性功能发生改变，因此单纯原代肝细胞培养构建的模型用于疾病过程及机制的研究缺乏重复性及实验结果的不准确性。而永生化肝细胞，对比于正常肝细胞而言其相关基因、蛋白及代谢功能表达存在差异，所以此类细胞构建的模型与临床NAFLD和NASH疾病同样存在差异，因此用于疾病过程
和机制的研究不具有特异性，使研究结果同样缺乏准确性。
[0006]同时相对于脂质代谢紊乱的肝脂肪变性研究，基于细胞构建的模型具有相对于动物模型的明显优势，如体外易于基因的干扰、药物的处理，以及较低的经费及较短的实验周期等。因此基于以上动物基因突变或缺陷、饮食及原代和永生化肝细胞模型构建的优缺点，寻找一种成型率高，重复性能好，体外原代肝细胞维持时间长功能保存完整的肝脂肪变性模型的构建方法，将为深入全面的研究肝脂肪变性或NAFLD进展机制奠定基础，并为临床筛选防治肝脂肪变性或NAFLD药物提供研究基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于一种基于细胞构建的一种非酒精性脂肪性肝病肝脂肪变性模型的构建方法。
[0008]本专利技术所采取的技术方案是：
[0009]本专利技术的第一方面，提供一种非酒精性脂肪性肝病模型构建的方法，包含以下步骤：
[0010]S1：将原代肝细胞贴附培养；
[0011]S2：将肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞消化后离心并弃去上清；
[0012]S3：将步骤S2所得肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞接种至S1培养的肝细胞中诱导培养。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1的具体操作为：将重悬的原代肝细胞按7.5～10.5
ꢀ×
104/cm2的密度贴附培养。
[0014]在本专利技术的一些优选实施方式中，步骤S1的具体操作为：将重悬的原代肝细胞按8.5
×ꢀ
104/cm2的密度贴附培养。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述贴附培养的容器被包被液包被。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述包被液主要成分选自胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种。
[0017]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述胶原蛋白为鼠尾胶原I。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1所述的贴附培养的培养液为包含胰岛素的低糖培养液。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述胰岛素的浓度为3.125～9.375μg/mL，优选为 6.25μg/mL。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述低糖培养液为DMEM低糖培养液。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述包含胰岛素的低糖培养液中还包含添加剂，所述添加剂包含双抗、转铁蛋白、亚硒酸、BSA、亚油酸、HEPEs、FBS和地塞米松中的至少一种。
[0022]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述包含胰岛素的低糖培养液的配方为：以DMEM (低糖,1g/L)为基础培养液，其中，双抗占培养液体积为0.5～1.5％、胰岛素的浓度为 3.125～9.375μg/mL、转铁蛋白的终浓度为3.125～9.375μg/mL、亚硒酸的终浓度为3.125～9.375μg/mL、BSA的终浓度为0.625～1.875μg/mL、亚油酸的终浓度为2.675～7.925μg/mL、 HEPEs的终浓度为10～20mM、FBS占培养液体积为5～15％以及地塞米松的终浓度为 0.01～0.50μg/mL。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述包含胰岛素的低糖培养液的配方为：以DMEM(低糖,1g/L)为基础培养液，其中，双抗占培养液体积为1％、胰岛素的浓度为6.25μg/mL、转铁蛋白的终浓度为6.25μg/mL、亚硒酸的终浓度为6.25μg/mL、BSA的终浓度为1.25μg/mL、亚油酸的终浓度为5.35μg/mL、HEPEs的终浓度为15mM、FBS占培养液体积为10％以及地塞米松的终浓度为0.4μg/mL。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S3所述的诱导培养的分化培养液为包含胰岛素的高糖培养液。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非酒精性脂肪性肝病模型构建的方法，包含以下步骤：S1：将原代肝细胞贴附培养；S2：将肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞消化后离心并弃去上清；S3：将步骤S2中肝星状细胞或人皮肤成纤维细胞接种至S1培养的肝细胞中诱导培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1的具体操作为：将重悬的原代肝细胞按7.5～10.5
×
104/cm2的密度贴附培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的贴附培养的培养液为包含胰岛素的低糖培养液；优选地，所述胰岛素的浓度为3.125～9.375μg/mL；优选的，所述低糖培养液为DMEM低糖培养液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述的诱导培养的分化培养液为包含胰岛素的高糖培养液；优选地，所述胰岛素的浓度为3.125～9.375μg/mL；优选的，所述高糖培养液为DME...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖将尉，高博韬，周宗宝，关淑文，
申请(专利权)人：广东省科学院健康医学研究所，
类型：发明
国别省市：