适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3D毛囊干细胞的培养方法组成比例

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3D毛囊干细胞的培养方法。该培养基以MEM培养基为基础，含有1

【技术实现步骤摘要】
适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3D毛囊干细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3D毛囊干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]成体干细胞(Adult somatic stem cells ，SCs)是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能APSC多能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，维持组织器官的更新、修复和重塑。成体干细胞在体内的增殖分化受到严格的稳态调控，在组织器官需要的时候能有效而及时的进行组织器官功能的修复。成体干细胞数量维持的调控机制尚待研究。
[0003]毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是存在于毛囊外根鞘隆突部（bulge region）的一种具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点的干细胞。人毛囊干细胞属于成体干细胞的一种，具有成体干细胞的共性，在体内处于静止状态，在激活状态下则表现出惊人的增殖分化能力。研究发现，毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。作为一种成体干细胞，HFSCs大多时间处于静息状态，在正常稳态下，只有一部分的HFSCs会被激活进入细胞周期，毛囊干细胞活化后生成primed HFSCs，再由primed HFSCs分化生成短暂增殖细胞（transit amplifying cells，TAC），TAC细胞是毛囊干细胞和有丝分裂后分化细胞（postmitotic differentiating cells，PDC）之间的一种过渡状态，来提供足够量的毛囊前体细胞，生成新的毛发。未活化的毛囊干细胞则通过缓慢的自我复制，来维持毛囊部位干细胞的数量。这种“自我更新
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定向分化”的平衡对于维持正常毛囊再生至关重要。
[0004]毛囊干细胞具有很高的增殖潜能，可诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等细胞，而植入体内则可分化形成神经元、黑色素细胞和角化细胞等，其在再生医学、创伤修复、和毛发再生等方面的作用长期以来受到研究者的关注。然而，在体外，单独培养毛囊干细胞无法实现无限扩增，随着毛囊干细胞在体外传代的代数增加，它的增殖分化能力也随之下降。毛囊干细胞体外培养时传代代数短，细胞分化严重等问题成为制约毛囊干细胞研究和应用的主要障碍；要保持毛囊干细胞的特性研究者都会通过与表皮角质细胞（epidermal keratinocytes）、成纤维细胞饲养层（fibroblast feeder layer）共同培养来维持毛囊干细胞多分化潜能。但共培养让研究者们难于精准的操控和检测毛囊干细胞的分化，一种成熟的体外培养毛囊干细胞的方法亟待开发。

技术实现思路

[0005]为克服毛囊干细胞体外培养时传代代数短，细胞分化严重等问题，本专利技术要解决的技术问题是提供一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方。
[0006]本专利技术要解决的另一个技术问题是提供上述用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方产品用于体外3D毛囊干细胞的培养方法，以提高毛囊干细胞体外培养的细胞数目和并且有效维持了毛囊干细胞的分化潜能。
[0007]本专利技术提供了一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方，该培养基以MEM培养基为基础，含有1
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10 ng/ml表皮生长因子（EGF）、1
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30 ng/ml成纤维细胞生长因子（FGF）、1
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30 ng/ml 血管内皮生长因子A（VEGF
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A）、1
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10μM ROCK抑制剂 Y27632和5
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10μg/ml 转铁蛋白。
[0008]较好的，该培养基的成分还包括：胰岛素，磷酸乙醇胺，乙醇胺，氢化可的松，谷氨酰胺，青霉素，链霉素中的一种或者若干种。
[0009]较好的，该培养基的成分还包括不多于10%的螯合胎牛血清。通常血清的加入量可以根据细胞培养的需要进行调控，通常在0
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15%，也可以是5
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10%。
[0010]较好的，培养基成分如下：MEM培养基的基础上添加5 μg/ml 胰岛素, 1
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10 ng/ml EGF, 1
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30 ng/ml FGF，1
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30 ng/ml VEGF
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A，1
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10μM Y27632, 5
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10μg/ml 转铁蛋白, 10μM 磷酸乙醇胺, 10 μM 乙醇胺(ethanolamine), 0.36 μg/ml 氢化可的松, 2 mM 谷氨酰胺, 100 U/mL青霉素 and 100 μg/ml链霉素, 8% 螯合胎牛血清。
[0011]更好的，上述的适用于毛囊干细胞体外培养的培养基中含有10 ng/ml EGF, 20 ng/ml FGF2，20 ng/ml FGF7，20 ng/ml VEGF
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A，5μM Y27632。
[0012]本专利技术的实验结果表明，毛囊干细胞在体外利用典型的FAD培养基在成纤维细胞饲养层上进行2D培养的条件下，其中的CD34+
ɑ
6+干细胞群体14天后就消失了。针对毛囊干细胞体外培养代数短、易分化的问题，本专利技术提供一种体外培养基配方及培养方案，模拟体内环境维持干细胞的长期生长和分化潜能。
[0013]本专利技术通过在培养基中添加ROCK 抑制剂 (Y27632)来防止体外培养的上皮细胞因为体外培养中细胞与细胞沟通机制的丧失而产生的失巢凋亡现象。在Y27632的存在下，上皮细胞以及毛囊干细胞的数量产生小幅增加。
[0014]本专利技术通过在培养基中添加适量EGF，FGF, 和 VEGF
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A，促进细胞增殖。
[0015]本专利技术提供了使用将所述适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方用于体外3D毛囊干细胞的培养方法，使用上述配置得到的培养基，配合matrigel基质胶，实现体外3D培养毛囊干细胞，matrigel基质胶主要成分包括：层黏连蛋白、胶原蛋白IV等，为毛囊干细胞提供适当的生长支架。
[0016]本专利技术还提供了一个体外3D培养毛囊干细胞的方法，能更好的维持干细胞的增殖分化潜能。利用Matrigel 中的层粘连蛋白（laminins）对毛囊干细胞的生长支持作用，通过添加Y27632, FGF, 和 VEGF
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A的培养基，上皮细胞经过14天培养后，CD34+
ɑ
6+毛囊干细胞群体显著增加5倍。Matrigel提供的3D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基，其特征在于，该培养基以MEM培养基为基础，含有1
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10 ng/ml EGF、1
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30 ng/ml FGF、1
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30 ng/ml VEGF
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A、1
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10μM Y27632和5
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10μg/ml 转铁蛋白。2.根据权利要求1所述适用于毛囊干细胞体外培养的培养基，其特征在于，该培养基的成分还包括：胰岛素，磷酸乙醇胺，乙醇胺，氢化可的松，谷氨酰胺，青霉素，链霉素中的一种或者若干种。3.根据权利要求1所述适用于毛囊干细胞体外培养的培养基，其特征在于，该培养基的成分还包括不多于10%的螯合胎牛血清。4.根据权利要求1至3任一项所述适用于毛囊干细胞体外培养的培养基，其特征在于，在MEM培养基的基础上添加5 μg/ml 胰岛素, 1
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10 ng/ml EGF, 1
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30 ng/ml FGF，1
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30 ng/ml VEGF
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A，1
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10μM Y27632, 5
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10μg/ml 转铁蛋白, 10μM 磷酸乙醇胺, 10 μM 乙醇胺, 0.36 μg/ml 氢化可的松, 2 mM 谷氨酰胺, 100 U/mL青霉素 and 100 μg/ml链霉素, 8% 螯合胎牛血清。5.根据权利要求1所述适用于毛囊干细胞体...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，田静，梁辉，李雪玲，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
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