非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。本发明专利技术的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098。本发明专利技术采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒抗原，较传统转瓶培养工艺、较大的简化了生产工艺，降低了生产成本。低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品领域，尤其涉及非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]乙型脑炎又称日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis Virus，JEV)引起的一种人畜共患传染病，我国将猪乙型脑炎归为二类动物疫病，猪乙型脑炎病毒归为第三类动物病原微生物。本病经由蚊虫媒介而传播，有严格的季节性，流行于6～10月，集中于7、8、9三个月。同时蚊虫也是本病毒的长期储存宿主，猪为最主要的增殖宿主和传染源，人群中以儿童感染发病率较高。动物感染发病症状表现为发病急，高温高热，流产，死胎，病死率较高。在该病流行期间，猪对乙型脑炎病毒感染率几乎可达100％，但很多时候处于隐形感染状态，成为人乙型脑炎感染的主要来源。
[0003]目前，已有4种不同类型的JEV疫苗：鼠脑灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗、细胞培养减毒活疫苗和基因工程减毒活疫苗。兽用乙型脑炎疫苗主要为鼠脑灭活疫苗和地鼠肾细胞乙型脑炎活疫苗。现有的猪乙型脑炎疫苗均存在一定的问题，如由鼠脑制备的疫苗存在成本高、杂蛋白多和易导致过敏反应等弊端，地鼠肾细胞活疫苗存在成本高，操作复杂，批间存在差异等弊端。
[0004]Vero细胞来源于非洲绿猴肾传代细胞，其优点是易于大规模培养，胞核学稳定，无外源因子污染，无致瘤性，是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质，适用于大规模疫苗生产用的细胞源。此外，国内商品化猪乙型脑炎疫苗均采用传统转瓶培养方式，存在细胞易污染、劳动强度大等缺点。与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养采用无血清培养，获得的细胞密度、病毒效价、产品质量均明显提高，无血清性外源病毒污染，生产能耗大幅降低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株。
[0006]本专利技术所提供的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株，命名为Vero
‑
zm，已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098。
[0007]本专利技术的的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株可用于病毒生产中，还可以用于生产疫苗中。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供一种制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法。
[0009]本专利技术所提供的制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法，包括：
[0010]采用权利要求1所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒；
[0011]收获所述猪乙型脑炎病毒液，添加硫酸鱼精蛋白，经离心、过滤、浓缩、分子筛凝胶层析，得到猪乙型脑炎病毒抗原。
[0012]其中，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在V
‑
SFM培养基上进行复苏和扩大培养。
[0013]其中，所述硫酸鱼精蛋白的终浓度1
‑
2mg/ml。
[0014]其中，所述猪乙型脑炎病毒为猪乙型脑炎病毒SA14
‑
14
‑
2。
[0015]其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒接种后孵育阶段的生物反应器的参数为：温度36～37℃，pH值7.2
±
0.1，溶氧40～60％，搅拌速度40～80rpm，通气量0.1～0.5SPLM。
[0016]其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒孵育后的培养阶段的生物反应器的参数为：温度33～35℃，pH值7.4～7.8，溶氧40～60％，搅拌速度80～120rpm，通气量0.1～0.5SPLM。
[0017]其中，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株的扩大培养阶段的生物反应器培养的参数为：溶氧20～60％，pH 7.0～7.4，搅拌转速80～120rpm/min，通气量0.1～0.5SPLM，温度35
‑
37℃。
[0018]本专利技术采用Vero
‑
zm生产猪乙型脑炎病毒抗原，较传统转瓶培养工艺、较大的简化了生产工艺，降低了生产成本。利用生物反应器的悬浮培养工艺生产猪乙型脑炎病毒SA14
‑
14
‑
2可以实现生物反应器的逐级放大，可获得高效价病毒抗原，减少批间差异，提升产品品质。采用Vero
‑
zm生产的猪乙型脑炎病毒SA14
‑
14
‑
2，收获病毒液后，利用病毒蚀斑测定病毒含量达10
7.5
PFU/ml以上。
具体实施方式
[0019]在下面的描述中，出于解释的目的，阐述了具体细节以便提供对本公开的理解。
[0020]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0021]如无特殊说明，本文提及的百分含量为质量百分含量。
[0022]实施例1、Vero全悬浮细胞株的制备
[0023]将适应乙型脑炎病毒SA14
‑
14
‑
2株的贴壁培养Vero细胞，作为候选悬浮驯化细胞。贴壁Vero细胞经过逐级悬浮专用培养基驯化及降血清适应两个阶段，制备成为全悬浮适应细胞株。
[0024]1、逐级悬浮驯化过程
[0025]将贴壁培养Vero细胞用胰蛋白酶消化后，以细胞1～2
×
106细胞/ml密度，按8％～10％浓度添加新生牛血清接种悬浮细胞瓶，置于恒温振荡器中，37℃，120rpm/min，5％的二氧化碳浓度下培养。分别以原培养基(DMEM)与悬浮专用培养基比例为75％：25％、50％：50％、25％：75％和0：100％的四种培养基比例进行驯化，以每种培养基配比传代细胞3代以上，达正常悬浮适应状态(细胞达到正常倍增速率，活率达90％以上)，进行下一个配比细胞传代，直至细胞完全适应悬浮专用培养基培养，并可稳定传代。
[0026]2、低血清悬浮驯化过程
[0027]通过逐级降低血清的方式驯化上述在8％～10％浓度新生牛血清的悬浮专用培养基中培养的悬浮细胞。逐步降低(分别为8％、6％、4％、2％)悬浮传代细胞的牛血清用量，每种血清浓度细胞稳定传代3代以上，达到细胞正常悬浮适应状态(细胞达到正常倍增速率，活率达90％以上)，进行下一个血清浓度细胞传代，直至细胞完全适应低血清悬浮培养，并
可稳定传代。将适应低血清的Vero全悬浮细胞株命名为Vero
‑
zm。
[0028]Vero
‑
zm已于2021年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23098。
[0029]Vero
‑
zm对不同培养基的适应性
[0030]从市面上挑选四种国产商品化的Vero悬浮培养专用培养基(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株，其特征在于，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098。2.权利要求1所述的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在病毒生产中的应用。3.一种制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法，包括：采用权利要求1所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒；收获所述猪乙型脑炎病毒液，添加硫酸鱼精蛋白，经离心、过滤、浓缩、分子筛凝胶层析，得到猪乙型脑炎病毒抗原。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在V
‑
SFM培养基上进行复苏和扩大培养。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸鱼精蛋白的终浓度1
‑
2mg/ml。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒为猪乙型脑炎病毒SA14
‑
14
‑
2。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩伟，黄书林，周建民，潘京学，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：