一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法，属于细胞培养技术领域。本发明专利技术中所述的制备方法包括如下步骤：(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，传代纯化1～3次得到纯度为100％的绵羊皮肤成纤维细胞。按照本发明专利技术的制备方法制备得到的绵羊成纤维细胞的纯度高，能达100％，可以稳定传代。可以稳定传代。可以稳定传代。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。

技术介绍

[0002]成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，也被称为纤维母细胞，广泛应用于动物基因功能、医药开发和胚胎技术研究等多个领域，通常单个细胞呈长纺锤形或不规则扁平状，细胞核在细胞中清晰可见呈规则圆形，胞质突起生长呈放射状。体外培养过程中成纤维细胞大多呈梭型、多角形和扁平星型。成纤维细胞体积大、数量多，具有较强的分裂增殖能力，活动旺盛，易培养。
[0003]皮肤成纤维细胞与羊毛生长发育密切相关，还是诸多羊毛生长发育相关基因体外功能研究的重要载体，因此对绵羊成纤维细胞的分离培养研究是羊毛发育机制以及绵羊育种研究的重要内容。
[0004]目前对绵羊皮肤成纤维细胞的分离培养方法文献较少，已有文献报道的绵羊成纤维细胞分离培养方法主要是取自绵羊早期胚胎组织，用胰蛋白酶消化法，离心去上清重悬培养。但该方法培养效果极不稳定，消化液的浓度和消化时间较难掌控，消化得到的细胞量较少且培养周期较长，需10天左右方可传代，最终获得的细胞活性较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；
[0009](2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；
[0010](3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。
[0011]作为优选，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；
[0012]所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；
[0013]所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。
[0014]作为优选，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；
[0015]步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；
[0016]所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。
[0017]作为优选，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；
[0018]步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；
[0019]所述离心的时间为10～12min。
[0020]作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃；
[0021]所述培养的CO2的浓度独立为4.5～5.5vt％。
[0022]作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h。
[0023]作为优选，步骤(2)所述离心的转速为800～1000rpm；
[0024]所述离心的时间为4～5min。
[0025]作为优选，所述DMEM高糖培养基中还包括如下体积浓度的组分：18～22％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。
[0026]作为优选，所述制备方法还包括传代纯化步骤；
[0027]所述传代纯化的方法为重复操作步骤(2)和步骤(3)所述的方法；
[0028]所述传代纯化的次数为1～3次；
[0029]所述传代纯化的培养基为DMEM高糖培养基；
[0030]所述DMEM高糖培养基还包括如下体积浓度的组分：8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。
[0031]本专利技术还提供了所述的制备方法制备得到的绵羊皮肤成纤维细胞，所述绵羊皮肤成纤维细胞的纯度≥85％。
[0032]本专利技术提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。该方法具有以下优点：
[0033](1)本专利技术的方法操作成功率较高，相比组织块法耗时短，减少细胞培养时间消耗，同时实验稳定性更强；本专利技术方法相比胰酶消化法和胶原酶消化法可以有效水解结缔组织、彻底消化肉块，获取更多的细胞，从而进一步缩短消化和培养时间，降低对细胞的影响，大大减少培养时间，提高了分离培养效率，同时获得贴壁率高、活性较强的成纤维细胞。
[0034](2)本专利技术的方法通过差速消化法和差速贴壁法共同进行细胞纯化，依据成纤维细胞消化速率快、贴壁速率高的特点进行纯化，获得绵羊皮肤成纤维细胞纯度更高，经2次纯化后P3代免疫荧光鉴定纯度达100％。
[0035](3)本专利技术采取出生10～14h的羔羊耳部组织，避免从母羊体内胎儿取样，做到最小损伤采样，且操作简单。
附图说明
[0036]图1为分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40
×
)；
[0037]图2为分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(100
×
)；
[0038]图3为分离培养得到P2代绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40
×
)；
[0039]图4为分离培养得到P3代绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40
×
)；
[0040]图5为分离培养得到绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(100
×
)；
[0041]图6为绵羊皮肤成纤维细胞Vimentin免疫荧光鉴定图；
[0042]图7为对比例1的方法分离培养48h后P1代羔羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40
×
)；
[0043]图8为对比例2的方法分离培养48h得到成年绵羊皮肤成纤维细胞显微镜图(40
×
)。
具体实施方式
[0044]本专利技术提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0045](1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；
[0046](2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；
[0047](3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。
[0048]在本专利技术中，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；
[0049]所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；
[0050]所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。
[0051]在本专利技术中，所述绵羊的出生时间优选为12h。
[0052]在本专利技术中，所述绵羊耳部组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；所述离心的时间为10～12min。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：管峰，胡馨予，徐爱春，葛建，刘军，石国庆，万鹏程，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：