一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法技术

本发明专利技术涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法，具体培养方法包括：使用微流控细胞芯片分析仪进行细胞培养、试验，具体步骤包括：步骤一，芯片预处理；步骤二，细胞接种；步骤三，细胞培养；在完成细胞培养后，将培养成功的细胞用于后续药物评价性检测，具体步骤包括：步骤一：检测准备；步骤二：检测LDH浓度；步骤三：活性检测；并且还可以使用活死细胞染色、免疫荧光检测以及炎症细胞因子检测，通过实施上述步骤操作，精确调控细胞生长区域的温度和气体成分，摆脱了外置培养箱，实现显微镜下对细胞的长期持续观察，微流控细胞模型能够更好的模拟人体微环境，进行药物评价效果更为精准。进行药物评价效果更为精准。进行药物评价效果更为精准。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法

：
[0001]本专利技术涉及细胞培养及药物毒性检测评价领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法。

技术介绍

[0002]现有的体外毒理学评价模型预测能力较差，这在很大程度上阻碍了医药研发的进程，建立和发展可靠的体外毒理学评价替代模型可以有效提升评价数据的准确性，但现有的要通过包括动物实验、体外实验等一系列毒理学评价手段来确定其药效及安全性或其评价数据，现有技术还没有建立仿人体环境人肾小球内皮细胞模型相关研究，导致临床前模型的缺乏和其较差的预测能力导致了大量药物在临床试验中的失败和开发新药的成本上升，可靠的体外毒理学评价替代模型并且仿人体环境进行培养是医药研发领域面临的迫切需求。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法，所述培养方法包括：
[0004]步骤一，芯片预处理
[0005]将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用；
[0006]所述步骤一中微流控细胞芯片上设置有进液孔1
‑
6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1
‑
8内灌注PBS缓冲液，之后将1
‑
8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1
‑
6号孔内加入PBS缓冲液300
‑
350ul，密封后室温静置30
‑
40min，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗，之后放置备用；
[0007]步骤二，细胞接种
[0008]将所述微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入人肾小球内皮细胞溶液10
‑
15ul，浓度为1
‑
5x106cells/ml；
[0009]将1号孔中加入含血清的培养基350ul；
[0010]向微流控细胞芯片施以0.25psi,8秒的加压条件，完成细胞向培养室的注入工作。
[0011]步骤三，细胞培养
[0012]以37℃、5％CO2气体浓度的条件对步骤二完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，此时1号孔向培养基通过重力自然持续灌流，细胞进行贴壁培养24h后备用。
[0013]进一步的，所述步骤二中向6号孔内加入的人肾小球内皮细胞溶液浓度为2x106cells/ml。
[0014]进一步的，所述步骤二中人肾小球内皮细胞溶液的加入量为15ul。
[0015]一种使用微流控芯片培育的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，该评价方
法包括下列步骤：
[0016]步骤A：检测准备，将1号、2号孔中液体吸干，在2号孔中加入受试物350ul进行干预，将2号孔进样压力设定为0.5
‑
1psi，以37℃、5％CO2气体浓度的条件下持续培养48h后进行毒性指标检测；
[0017]步骤B：检测LDH浓度，将步骤一中获得的细胞培养液进行收集，将细胞培养液置于LDH试剂盒，检测LDH浓度，记录检测结果；
[0018]步骤C：活性检测，加入CCK
‑
8检测工作液，以3psi、37℃、5％CO2气体浓度的条件进行孵育1
‑
6h，将产物转入细胞培养板中，将细胞培养板置于酶标仪待检，酶标仪吸光度设定为450nm，检测，记录检测结果；
[0019]进一步的，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行离心处理。
[0020]进一步的，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行过滤处理。
[0021]进一步的，所述步骤C中检测孵育时间为4h。
[0022]进一步的，该评价方法还包括：活死细胞染色，将步骤A中细胞加入活死细胞染料，调节微流控芯片压力为2
‑
3psi，染色30min后进行荧光观察，记录观察结果；
[0023]进一步的，该评价方法还包括：免疫荧光染色，将步骤A中细胞加入4％甲醛固定细胞，封闭后加一抗和二抗孵育后进行荧光观察，记录观察结果。
[0024]进一步的，所述一抗浓度为1:50。
[0025]优点效果
[0026]本专利技术利用微流控细胞芯片分析仪培养人肾小球内皮细胞，通过微培养控制器精确调控细胞生长区域的温度和气体成分，摆脱了外置培养箱的限制，实现了显微镜下对细胞的长期持续观察。区别于传统的体内外药物毒性评价模型，微流控细胞模型能够更好的模拟人体微环境，进行药物评价效果更为精准。
附图说明
[0027]图1为本专利技术的培养人肾小球内皮细胞的培养效果图；
[0028]图2为本专利技术实施例1使用CCK
‑
8试剂盒进行细胞活性检测得到的数据条形图；
[0029]图3为本专利技术的实施例1经LDH漏出检测得到的数据条形图；
[0030]图4为本专利技术的实施例1经活死细胞染色检测观察后的得到的细胞染色图；
[0031]图5为本专利技术的实施例1经免疫荧光染色检测观察后的得到的细胞染色图；
[0032]图6为本专利技术的实施例1经炎症细胞因子检测得到的数据条形图；
[0033]图7为本专利技术的对比例5使用CCK
‑
8试剂盒进行细胞活性检测得到的数据条形图；
[0034]图8为本专利技术的对比例5经LDH漏出检测得到的数据条形图；
[0035]图9为本专利技术的对比例5经活死细胞染色检测观察后的得到的细胞染色图；
[0036]图10为本专利技术的对比例5经免疫荧光染色检测观察后的得到的细胞染色图；
[0037]图11为本专利技术的对比例5经炎症细胞因子检测得到的数据条形图。
具体实施方式
[0038]下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
[0039]本专利技术涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评
价方法，具体培养方法包括：
[0040]步骤一，芯片预处理
[0041]将微流控细胞芯片上设置的进液孔1
‑
6列和排液孔7列以及8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1
‑
8内灌注PBS缓冲液，之后将1
‑
8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1
‑
6号孔内加入PBS缓冲液300
‑
350ul，密封后室温静置30
‑
40min，使微流控芯片内部压力平衡，调整的适宜pH便于后续细胞培养完成，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗和灭菌处理，并准备胶垫，清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用，经过该步骤预处理的微流控芯片将用于后续的人肾小球内皮细胞的接种、培养以及观察等试验步骤。
[0042]步骤二，细胞接种
[0043]将步骤一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：步骤一，芯片预处理将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用；所述步骤一中微流控细胞芯片上设置有进液孔1
‑
6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1
‑
8内灌注PBS缓冲液，之后将1
‑
8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1
‑
6号孔内加入PBS缓冲液300
‑
350ul，密封后室温静置30
‑
40min，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗，之后放置备用；步骤二，细胞接种将所述微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入人肾小球内皮细胞溶液10
‑
15ul，浓度为1
‑
5x106cells/ml；将1号孔中加入含血清的培养基350ul；向微流控细胞芯片施以0.25psi,8秒的加压条件，完成细胞向培养室的注入工作。步骤三，细胞培养以37℃、5％CO2气体浓度的条件对步骤二完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，此时1号孔向培养基通过重力自然持续灌流，细胞进行贴壁培养24h后备用。2.根据权利要求1中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤二中向6号孔内加入的人肾小球内皮细胞溶液浓度为2x106cells/ml。3.根据权利要求1中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤二中人肾小球内皮细胞溶液的加入量为15ul。4.一种使用权利要求1
‑
3中培育的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，该评价方法包括下列步骤：步骤A：检测准备，将1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倬，秦文，霍军生，陈頔，殷继永，黄建，朴玮，王晶波，王丽媛，卓勤，宫照龙，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心营养与健康所，
类型：发明
国别省市：