Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。本发明专利技术揭示了一种全新分离的细胞群，其为Gli1+细胞群，较佳地其为EpCAM+/Gli1+细胞群。所述细胞具有肝干/祖细胞特性，具有分化/转分化形成肝细胞的功能、肝脏损伤修复作用，以及能够形成肝脏类器官。本发明专利技术还提供了分选所述细胞的方法，利用所述细胞来制备肝脏类器官的方法等。本发明专利技术为肝损伤修复机理提供了新支持，为肝脏再生的研究和临床应用提供了新途径。床应用提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域；更具体地，本专利技术涉及Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。

技术介绍

[0002]肝脏作为机体内最大的实质性器官，也是人体内最大的消化腺，在维持机体新陈代谢过程中处于核心地位，且具有强大的解毒能力和再生能力。当肝脏受到病毒、药物、酒精等致病因素的损伤后，残存肝组织可再生恢复至原有体积和重量，最终达到肝脏组织结构的重建及肝功能的恢复。临床上常见的慢性、持续性的肝脏损伤，对肝脏功能损害表现明显。研究表明，参与肝脏损伤修复过程的细胞种类与肝损伤的程度密切相关。在肝脏受到轻度损伤时，主要由肝实质细胞发生增殖，进行损伤修复。而肝脏受到严重损伤且肝细胞再生发生障碍时，肝细胞坏死增多，无法仅仅依靠肝细胞再生完成修复，往往需要肝非实质性的细胞的参与。在这种情况下，肝组织将启动包括肝干/祖细胞分化、胆管细胞转分化和肝细胞的去分化等在内的过程对受损的肝脏进行修复(图1)。
[0003]然而，到目前为止，对受损肝脏如何启动这一过程的分子机制却所知甚少。近年研究显示，肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助部分肝衰竭患者渡过危险期等待肝移植，在部分肝衰竭患者肝细胞移植甚至可以直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择。尽管肝细胞在体内具有强大的损伤修复能力，但是在体外成熟肝细胞的长时间培养一直是一个世界性难题，这也对相关肝损伤疾病的临床治疗形成了制约。
[0004]因此，肝脏损伤修复过程的分子机制以及在此基础上进行体外肝细胞长期培养和进一步的人工干预肝细胞的增殖仍然是生命科学目前研究的重点之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供细胞或细胞培养物的应用，用于：制备转分化形成肝细胞的组合物，制备进行肝脏损伤修复的组合物，或制备肝脏类器官；其中，所述细胞为Gli1+细胞，且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
[0007]在一个优选例中，所述的组合物包括培养物。
[0008]在另一优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
[0009]在另一优选例中，所述细胞还包括选自下组的特征：具有上皮(样)细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质(样)细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管(样)细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
[0010]在另一优选例中，所述胆管细胞标志物包括选自下组的标志物：KRT19、SOX9。
[0011]在另一优选例中，所述上皮细胞标志物包括选自下组的标志物：EpCAM，KRT7 和
KRT19。
[0012]在另一优选例中，所述间质细胞标记物包括选自下组的标志物：PDGFRα和 PDGFRβ。
[0013]在另一优选例中，所述的细胞包括传代的细胞。
[0014]在另一优选例中，所述传代的细胞，包括传代1～30代，更具体如2，3，5，8， 10，12，15，18，20，25代。
[0015]在本专利技术的另一方面，提供一种分离的细胞或细胞培养物，所述细胞为Gli1+ 细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
[0016]在一个优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
[0017]在另一优选例中，所述的细胞还包括选自下组的特征：具有上皮(样)细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质(样)细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管(样)细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
[0018]在另一优选例中，所述Gli1+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。
[0019]在另一优选例中，所述Gli1+和EpCAM+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
[0020]在另一优选例中，所述的肝组织的分离物包括：肝脏组织或对组织进行处理后的产物，更具体如细胞悬液。
[0021]在本专利技术的另一方面，提供一种分离或富集细胞或细胞培养物的方法，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官；所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。
[0022]在一个优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞，所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
[0023]在另一优选例中，所述分选细胞的方法包括(但不限于)：流式细胞分选法，免疫磁珠分选法，微流控细胞分选法，粘附法。
[0024]在本专利技术的另一方面，提供一种制备肝脏类器官的方法，包括：培养前面任一所述的细胞或细胞培养物，使之生长和分化，从而获得肝脏类器官。
[0025]在一个优选例中，所述方法包括：
[0026](1)提供前面任一所述的细胞或细胞培养物，或利用前面任一所述的方法获得细胞或细胞培养物；
[0027](2)将(1)的细胞或细胞培养物进行生长培养；较佳地还进行1～5次(如2，3，4 次)传代；
[0028](3)将(2)获得的培养物进行分化培养，从而获得肝脏类器官。
[0029]在另一优选例中，(2)中，进行生长培养的培养基中含有Advance DMEM/F12培养
液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，N-Acetylcysteine， Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2，R-Spondin，Noggin。
[0030]在另一优选例中，(3)中，进行分化培养的培养基中，含有Advance DMEM/F12 培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632， DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。
[0031]在另一优选例中，进行生长培养的培养基中，含有：Advance DMEM/F12培液，以及：10mM HEPES，2nM GlutaMAX-1，500
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.细胞或细胞培养物的应用，用于：制备转分化形成肝细胞的组合物，制备进行肝脏损伤修复的组合物，或制备肝脏类器官；其中，所述细胞为Gli1+细胞，且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述细胞还包括选自下组的特征：具有上皮细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管细胞特征，或表达胆管细胞标志物。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胆管细胞标志物包括选自下组的标志物：KRT19、SOX9；所述上皮细胞标志物包括选自下组的标志物：EpCAM，KRT7和KRT19；或所述间质细胞标记物包括选自下组的标志物：PDGFRα和PDGFRβ。5.如权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述的细胞包括传代的细胞。6.一种分离的细胞或细胞培养物，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。7.如权利要求6所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。8.如权利要求7所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述的细胞还包括选自下组的特征：具有上皮细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管细胞特征，或表达胆管细胞标志物。9.如权利要求6～8任一所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述Gli1+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出；或所述Gli1+和EpCAM+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。10.一种分离或富集细胞或细胞培养物的方法，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官；所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞，所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述分选细胞的方法包括：流式细胞分选法，免疫磁珠分选法，微流控细胞分选法，粘附法。
13.一种制备肝脏类器官的方法，包括：培养权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物，使之生长和分化，从而获得肝脏类器官。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物，或利用权利要求1～5任一所述的方法获得细胞或细胞培养物；(2)将(1)的细胞或细胞培养物进行生长培养；较佳地还进行1～5次传代；(3)将(2)获得的培养物进行分化培养，从而获...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵允，高栋，彭甲银，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：