一种血管化脂肪类器官培养方法技术

本发明专利技术提供了一种血管化脂肪类器官培养的方法，所述方法包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分。本发明专利技术使用促血管生长因子和血管化脂肪类器官培养基在三维培养条件下诱导小鼠内脏脂肪干细胞自发形成血管化脂肪类器官，改进了传统脂肪三维培养方法。本方法可操作性强，实验可重复性高，成本较低，为脂肪生物学和肥胖研究提供操作简便，易于定量分析，并能反映动物体内脂肪发育模式的体外新模型。发育模式的体外新模型。发育模式的体外新模型。

【技术实现步骤摘要】
Bio， 2014， 15(10): 647
‑
64.）。但是在脂肪研究领域，还缺乏成熟的类器官模型。尽管已有人利用磁珠、水凝胶等材料三维培养人和小鼠脂肪细胞系和脂肪来源血管基质组分（LOUIS F， PANNETIER P， SOUGUIR Z， et al. A biomimetic hydrogel functionalized with adipose ECM components as a microenvironment for the 3D culture of human and murine adipocytes [J]. Biotechnology and Bioengineering， 2017， 114(8): 1813
‑
24.），并进行成脂诱导，但这些模型还不能有效模拟出体内脂肪组织中细胞的发育时序、多种细胞类型及其所处的微环境，而且操作较为复杂，培养批次性明显，尚缺乏规范化的培养方案。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种低成本、规范化的脂肪类器官的培养方法。
[0007]为了达到上述的实验目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术所述的培养方法中的胎牛血清（FBS）、DMEM/F12、TrypLE、I型胶原酶购自ThermoFisher；本专利技术所述的血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子，表皮生长因子，R3
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胰岛素样生长因子
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1，抗坏血酸，氢化可的松，庆大霉素/两性霉素，血管内皮细胞基础培养基EBM
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2购自Lonza公司；本专利技术所述的超低吸附板、基质胶购自康宁公司。
[0008]所述的一种血管化脂肪类器官培养方法，包括i，ii两个部分：i.分离获取小鼠内脏脂肪干细胞：在分离小鼠内脏脂肪干细胞之前，首先配制脂肪组织消化液和冲洗液，脂肪组织消化液含体积比为2%双抗、97%HBSS缓冲液，质量分数为1%的BSA、及质量浓度为1mg/ml的I型胶原酶，冲洗液包含体积比为2%胎牛血清、2%青霉素/链霉素双抗和96%HBSS缓冲液。
[0009]优选地，配制好脂肪组织消化液和冲洗液之后用0.22μm滤膜过滤后4℃冰箱备用。
[0010]更优选的，脂肪组织消化液和冲洗液中的青霉素/链霉素双抗可用庆大霉素/两性霉素替代，二者对应比例：10000U青霉素/10mg链霉素：3mg庆大霉素/1.5μg两性霉素。
[0011]在无菌条件下打开小鼠腹腔，分离小鼠附睾旁白色脂肪组织，置于装有冲洗液的10cm细胞培养皿，将其转移进超净台，用冲洗液冲洗2~3次去除内脏脂肪组织的污物。然后将内脏脂肪组织转入5ml离心管，用手术剪充分剪碎后加入等体积内脏脂肪组织消化液，置于37℃，150 rpm摇床消化30min。取出含有脂肪组织的消化液，用等体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，经过100μm和70μm的滤网两次过滤后，300g，5min离心去上清，然后DMEM/F12培养基重悬洗涤沉淀细胞两次，最后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬细胞后，将其移入细胞培养板后置于37℃，5%CO2的条件下培养4
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6h，根据脂肪干细胞强贴壁性的特性，4
‑
6h后进行换液，得到小鼠内脏脂肪干细胞。
[0012]ii. 血管化脂肪类器官培养：血管化脂肪类器官培养前需配制血管化脂肪类器官培养基，包括脂肪干细胞维持培养基，脂肪干细胞血管化诱导培养基，血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基，血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基和血管化脂肪类器官维持培养基。
[0013]脂肪干细胞维持培养基包括DMEM/F12培养基、胎牛血清、碱性成纤维生长因子、青霉素和链霉素。青霉素浓度10U/ml，链霉素10μg/ml，胎牛血清的体积分数为12%，碱性成纤
维生长因子在培养基中的质量浓度为10ng/ml。
[0014]脂肪干细胞血管化诱导培养基：包括胎牛血清、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、R3
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胰岛素样生长因子
‑
1、抗坏血酸、氢化可的松、庆大霉素/两性霉素和血管内皮细胞基础培养基EBM
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2。培养基中胎牛血清的体积比为5%，血管内皮生长因子、表皮生长因子、R3
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胰岛素样生长因子、抗坏血酸、氢化可的松、庆大霉素、两性霉素的质量浓度分别为0.5ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、1μg/ml、 0.2μg/ml、 30μg/ml、15ng/ml。
[0015]血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基由DMEM/F12、胰岛素、地塞米松、罗格列酮、3
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异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗组成，培养基中胎牛血清体积比为15%、胰岛素、地塞米松、罗格列酮、3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤、青霉素、链霉素的浓度分别为10μg/ml、1μM、1μM、0.5mM、10U/ml、10μg/ml，其余成分为DMEM/F12；血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基由DMEM/F12、胰岛素、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗组成，培养基中胎牛血清体积比为12%，胰岛素、青霉素、链霉素的浓度分别为5μg/ml、10U/ml、10μg/ml，其余成分DMEM/F12；血管化脂肪类器官维持培养基包括体积比为10%胎牛血清、体积比为1%青霉素/链霉素双抗，其余成分为DMEM/F12培养基。
[0016]采用脂肪干细胞维持培养基在37℃，5%CO2条件下培养扩增分离得到的小鼠内脏脂肪干细胞。
[0017]优选地，将小鼠内脏脂肪干细胞置于5%O2低氧环境下进行培养。
[0018]在小鼠内脏脂肪干细胞培养扩增至2至3代，细胞数量达10
6 以上时进行三维内脏脂肪干细胞球制备，采用的方法为悬滴法。
[0019]将培养扩增的小鼠内脏脂肪干细胞用0.25%胰蛋白酶消化1min，然后用两倍体积的完全培养基中止消化，吹打混匀后得到的单细胞悬液，取20μL进行细胞计数。300g，5min离心去上清，根据细胞计数结果，向细胞沉淀中加入适量的完全培养基重悬，调整细胞悬液浓度为4
×
105~5
×
105/ml，使用移液枪，按20μL每个悬滴的量将制备悬滴于10cm细胞培养板顶盖内侧，并在细胞培养板的底部加入无菌水，以维持湿度。
[0020]优选地，采用TrypLE替代胰蛋白酶对小鼠内脏脂肪干细胞进行消化传代，可减少对其增殖活性的影响。
[0021]将已形成细胞球的脂肪干细胞用1mL枪头转移至含有500μL脂肪干细胞血管化诱导培养基的24孔超低吸附板中，每孔3
‑
4个细胞球，将超低吸附板置于37℃，5%CO2条件下2天，诱导小鼠内脏脂肪干细胞向血管内皮细胞定向。
[0022]取Paraflim封口膜置于384孔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血管化脂肪类器官培养方法，其特征在于，包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分，具体步骤如下：人道处死小鼠；获取小鼠脂肪组织：无菌条件下打开小鼠腹腔获取内脏脂肪组织，并使用2
‑
8℃的脂肪组织冲洗液冲洗小鼠内脏脂肪2~3次去除污物；消化脂肪组织：眼科剪剪碎脂肪组织，使用包括1mg/ml的I型胶原酶，体积比为2%青霉素/链霉素双抗，体积比1%的BSA和体积比为97%HBSS缓冲液脂肪组织消化液37℃，30min，150rpm恒温摇床消化脂肪组织；得到单细胞悬液：等体积DMEM/F12完全培养基终止消化，100μm和70μm细胞滤网过滤脂肪组织消化液两次后，300g，5min离心去上清，使用红细胞裂解液裂解红细胞，培养基重悬细胞得到单细胞悬液；2D培养扩增脂肪干细胞：将得到的单细胞悬液接种于组织处理细胞培养皿，补足培养基，放入37℃，5%CO2或37℃，5%CO
2，
5%O2培养箱中，4
‑
6h后换液得到高纯度脂肪干细胞，2
‑
3天后传代继续培养扩增脂肪干细胞；悬滴培养：将培养扩增后的脂肪干细胞胰酶或TrypLE消化后，完全培养基终止消化，采用悬滴法使小鼠内脏脂肪干细胞形成三维脂肪干细胞球，悬滴培养2
‑
3天，每个细胞球含有的细胞数为8000
‑
10000；血管化诱导：使用脂肪干细胞血管化诱导培养基在超低吸附板中悬浮培养诱导小鼠内脏脂肪干细胞2天，诱导小鼠内脏脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，使用Paraflim封口膜和384孔PCR板构建多孔模具，将脂肪干细胞血管化诱导培养基培养两天的小鼠内脏脂肪干细胞球转移至模具内，模具中每孔放置一个脂肪干细胞球，采用8~12mg/ml浓度基质胶包埋细胞球，将模具置于细菌或细胞培养皿皿底，倒置放入37℃细胞培养箱30min，待基质胶固化后用脂肪干细胞血管化诱导培养基将含有小鼠内脏脂肪干细胞球的基质胶转移至超低吸附板中继续悬浮诱导4~5天，2~3天换液，使其形成分支状血管结构；成脂诱导：使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基对小鼠脂肪类器官进行3天的成脂诱导定向，之后使用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基对血管化脂肪类器官继续成脂诱导10
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12天，使之形成具有直径超过40μm成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官；维持培养：使用血管化脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新霞，骆曜骏，刘有华，陈雨诗，刘禹熙，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：