【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，更具体地，本专利技术涉及一种体外扩增培养肝细胞的方法以及利用扩增后肝细胞进行代谢分析及细胞移植的应用。
技术介绍
1、肝脏是体内功能最多且最复杂的实质脏器之一，主要功能包括调控糖类和脂质的平衡、参与外源性物质代谢与生物转化、胆汁的生成和排泄、维生素的储存、分泌性蛋白质的合成、凝血物质的生成与消除，并在特异性和非特异性免疫中具有重要作用。肝脏作为人体物质代谢的中心，在多种生理和病理过程中都发挥了重要的作用，很多疾病也会累及肝脏。目前对于晚期肝脏疾病最有效的治疗手段是肝脏移植，但是由于供体肝源的短缺和昂贵的治疗费用，使其临床应用受到很大的限制。近些年研究者们尝试利用肝细胞移植替代整肝移植，并已经在临床和动物模型中验证了其有效性。但是肝细胞移植治疗方法仍受限于具有肝脏整合能力的人肝细胞来源匮乏的问题。此外，由于人嗜肝性病原体具有宿主特异性和物种间肝脏代谢酶存在巨大差异，人肝细胞移植免疫缺陷动物获得的肝脏人源化动物被广泛应用于肝脏感染疾病研究和药物研发领域。因此，具有高效肝脏再生(再殖)能力的人肝细胞在肝病治疗和肝脏人源化动物构建中都具有巨大的需求及应用价值。
2、细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。肝细胞自发永生化的几率很小,通常肝细胞永生化是借助基因转染等技术实现。但是，一些永生化肝细胞系体外肝功能远低于原代肝细胞，而且没有实验证实其能在肝脏中大量再生(再殖)。此外，有些永生化细胞还存在体内致瘤的风险。
3、本领域人员也
4、本领域人员也采取了类器官体方式培养人肝脏胆管来源前体细胞，但是此类培养获得的培养出来了可持续增殖的肝类器官体，肝功能即使在诱导后也远不如人原代肝细胞，而且体内移植整合效率非常低。
5、本领域人员也进行了鼠肝细胞体外退分化为肝前体细胞，此类培养技术的优势在于体外大规模扩增肝细胞，且移植后可以高效地实现肝脏再生。但该技术无法促使人肝细胞在体外扩增。
6、综上所述，尽管研究者在人肝细胞培养和肝脏再生新机制取得多项突破性进展。但目前尚无法实现人肝细胞在无基因编辑情况下，持续增殖并在体内具有高效的再殖能力。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供肝细胞的体外扩增培养方法及应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种体外扩增肝细胞(包括：原代肝细胞)的方法，包括：以含有wnt信号通路激活剂的细胞培养基培养肝细胞，使之体外扩增。
3、在一个优选例中，所述的细胞培养基中还含有选自下组的成分：n-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，fgf10，egf，hgf，[leu15]-gastrin i，a 83-01，y-27632的细胞培养基。
4、在另一优选例中，所述的wnt信号通路激活剂包括选自下组的激活剂：wnt3a蛋白，wnt3a条件培养基，chir，或其组合。
5、在另一优选例中，所述的细胞培养基中，还包括选自下组的细胞生长添加剂：n2添加物，b27添加物；或还包括血清。
6、在另一优选例中，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：dmem、mem、rpmi(如rpmi1640)、neuronal basal或fischers；较佳地，所述的dmem选自：advanced dmem/f12，dmem/f12。
7、在另一优选例中，所述方法还包括：将扩增的肝细胞诱导为成熟肝细胞，包括：在所述的细胞培养基中添加forskolin，地塞米松，制瘤素m。
8、在另一优选例中，所述组分在细胞培养基中的浓度为：
9、
10、
11、在另一优选例中，所述的wnt3a蛋白、wnt3a条件培养基、chir可以选择其一，或其组合。
12、在另一优选例中，所述的n2添加物用量为1x。
13、在另一优选例中，所述的b27添加物用量为1x。
14、在另一优选例中，所述方法还包括：将扩增的肝细胞进行传代培养；较佳地，在低氧条件下进行传代培养，所述的低氧为按照体积比氧气含量0～15％；较佳地，氧气含量低于10％，更佳地，氧气含量低于6％，如1％，2％，3％，4％；较佳地，所述的培养为三维条件下的培养。
15、在另一优选例中，所述的肝细胞为人肝细胞，包括人原代肝细胞。
16、在本专利技术的另一方面，提供由前面任一所述的方法获得的肝细胞培养物或从该肝细胞培养物中分离纯化的肝细胞。
17、在一个优选例中，所述的肝细胞为处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞。
18、在另一优选例中，所述的肝细胞为成熟肝细胞；较佳地，其具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核，其肝前体基因如sox9、ck19或ck7低表达，参与药物和尿素代谢的关键基因高表达，cyp2b6和尿素代谢能力增加。
19、在本专利技术的另一方面，提供所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞的用途，用于：制备促进肝脏再生的药物；用于制备预防、缓解或治疗肝脏疾病(包括肝损伤，肝癌，肝硬化等)的药物组合物或药盒；用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究；用于制备体内细胞移植的组合物；或用于产生albumin蛋白。
20、在一个优选例中，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性物质、筛选调节肝细胞功能的物质。
21、在本专利技术的另一方面，提供一种药物组合物，其中含有所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞；以及药学上可接受的载体。
22、在本专利技术的另一方面，提供一种药盒，其中含有所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞；或含有所述的药物组合物。
23、在本专利技术的另一方面，提供用于体外扩增肝细胞的培养基，其包括：wnt信号通路激活剂，n-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，fgf10，egf，hgf，[leu15]-gastrin i，a 83-01，y-27632的细胞培养基；其中，所述的wnt信号通路激活剂选自：wnt3a蛋白，wnt3a条件培养基，chir，或其组合。
24、在一个优选例中，所述的培养基还包括选自下组的组分：n2添加物，b27添加物，血清。
25、在本专利技术的另一方面，提供用于体外扩增肝细胞及诱导肝细胞成熟的培养基，其包括所述的体外扩增肝细胞的培养基，以及forskolin，地塞米松，制瘤素m。
26、在一个优选例中，所述的wnt信号通路激活剂，n-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，fgf10，egf，hgf，[leu15]-gastrin i，a 83-01，y-27632的细胞培养基。
27、在另一优选例中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞；其由体外扩增肝细胞的方法获得，包括：
2.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述组分的浓度为：
3.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI、Neuronal basal或Fischers；较佳地，所述的DMEM选自：Advanced DMEM/F12，DMEM/F12。
4.如权利要求1～3任一所述的中间态细胞，其特征在于，按照体积比氧气含量低于10％；较佳地按照体积比氧气含量低于6％。
5.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述的培养为三维条件下的培养。
6.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述的肝细胞为人肝细胞。
7.权利要求1～6任一所述的中间态细胞的用途，用于：
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性物质、筛选调节肝细胞功能的
9.一种药物组合物，其特征在于，其中含有权利要求1～6任一所述的中间态细胞；以及药学上可接受的载体。
10.一种药盒，其特征在于，其中含有权利要求1～6任一所述的中间态细胞。
11.一种药盒，其特征在于，其中含有权利要求9所述的药物组合物。
...【技术特征摘要】
1.一种处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞；其由体外扩增肝细胞的方法获得，包括：
2.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述组分的浓度为：
3.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：dmem、mem、rpmi、neuronal basal或fischers；较佳地，所述的dmem选自：advanced dmem/f12，dmem/f12。
4.如权利要求1～3任一所述的中间态细胞，其特征在于，按照体积比氧气含量低于10％；较佳地按照体积比氧气含量低于6％。
5.如权利要求1所述的中间态细胞，其特征在于，所述的培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：惠利健，张鲁狄，张坤，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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