人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法技术

本发明专利技术涉及人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，包括：从目标样本中提取DNA；在反应管的LcnPCR第一次反应空间中进行第一级PCR反应，不开盖转移一级扩增产物至LcnPCR第二次反应空间中进行第二级PCR反应；第二级PCR采用染料法，并监测融解曲线；若融解曲线无特异峰则该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的HPV序列与HPV标准序列进行比对鉴别出HPV的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则对二级扩增产物进行第三级PCR反应获得三级扩增产物，经二代测序确定样本所含HPV的各亚型。本发明专利技术将一代测序与二代测序相结合，提高实验灵敏度和特异性，确保实验结果的可靠性和准确性。的可靠性和准确性。的可靠性和准确性。

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法


[0001]本专利技术涉及一种人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。人乳头瘤病毒(HPV)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。HPV在99％宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。
[0003]研究表明与基因型分析有关的是HPV基因组图谱中那些显示特定类型多态性的区域。HPV基因组图谱中存在多个类型特异性序列变异性区域，但编码主要衣壳蛋白的晚期区域基因L1似乎是最具多态性的1‑4。此外，早期区域基因E6和E7存在序列多态性5‑7。这些序列的差异赋予个体HPV类型不同程度的致癌转化潜力，它们也可用于开发特定类型的分子测试。L1基因片段最常用于基于PCR的基因分型分析
1,3
。引物选自位于多态性、类型特异性序列两侧的保守或共有序列。
[0004]目前主要有3类用于检测HPV的核酸杂交方法。第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Sourthern印迹和点印迹等法
8,9
。但其缺点是灵敏度低、技术耗时且需要大量纯化的HPV探针。
[0005]第二类是信号放大法，但该类技术是不属于公共领域的专有技术。如美国Digene公司的杂交捕获法(Hybrid Capture)，HC2是其拥有的专有核酸杂交信号放大系统，是目前美国获得FDA批准并在国际上临床最广泛使用的一种检测HPV DNA的检测技术。该技术主要是将针对包含要检测的HPV基因型的单个DNA序列的特定RNA探针与单束HPV DNA杂交，通过化学发光检测到RNA/DNA杂交物。HC2能检测到的HPV基因型可分为以下风险等级：5种低风险HPV6、11、42、43和44型；以及13种高/中风险HPV类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。HC2可以检测出混合高危型HPV，但是不能检测出单一高危HPV基因型，因此其在HPV基因型的细分上能力有限。另外，HC2检测存在着高比率的假阴性和假阳性。
[0006]第三类方法是基于PCR的靶序列片段扩增技术，应用PCR对特异性HPV靶序列片段进行扩增，用特异性的寡核苷酸探针鉴别HPV型别。此类检测法的优点是：取样简便，检测及结果报告人为因素影响极少，适合在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛。缺点是大多数PCR方法虽然通常仅用于研究用途测试，但通常涉及使用获得专利的HPV序列，由于法律或专有技术限制，限制了它们作为体外诊断测试的适用性。
[0007]该类目前主要检测方法有：特异性PCR(Type
‑
specific PCR)法：该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份PCR，则导致无法高通量的使用。
[0008]PCR技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量呈指数倍数增加。
[0009]DNA的变性一般发生在约90
‑
95℃，引物一般在约40
‑
60℃退火至变性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70
‑
75℃进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。
[0010]PCR技术具有广泛的生物学应用，例如：DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染等。然而，在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。
[0011]在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。
[0012]此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1
‑
10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。
[0013]综上所述，目前还缺乏在封闭反应体系中，对PCR扩增产物简便有效地进行定量或半定量转移的方法。
[0014]洪国藩院士研究团队曾于2012年申请专利技术专利：多级PCR检测HPV的方法和试剂盒，该专利技术技术方案的主要创新点为采用多级PCR反应管，包括二个或多个可封闭的PCR反应腔或隔室，并且在至少两个隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从上游隔室转移至下游隔室；对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，构成一个封闭空间，可有效消除PCR交叉干扰。
[0015]此外，根据洪院士团队以往经验，大约有7％的人会同时感染多种HPV亚型，此时一代测序会出现套峰，无法准确分型。基于针对不同亚型的病毒设计特异性引物进行分型PCR，即一份样本需要用20多个PCR反应进行鉴别，同时需要分别电泳。该方法工作量较大，不适用于大规模的检测。亟待研发出改进的鉴别方法。
[0016]以上内容涉及的参考文献如下：
[0017]1.Meyer T,Arndt R,Stockfleth E,Flammann HT,Wolf H,Reischl U.Strategy for typing human papillomaviruses by RFLP analysis of PCR products and subsequent hybridization with a generic probe.BioTechniques.1995；19(4)：632
‑
639.
[0018]2.Rady PL,Arany I,Hughes TK,Tyring SK.Type
‑
specific primer
‑
mediated direct sequencing of consensus primer
‑
generated PCR amplicons of human pap本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、采用DNA提取试剂盒从目标样本中提取核酸DNA；第二步、在封闭的反应管的LcnPCR第一次反应空间中，以HPV基因组DNA为模板，通过HPV特异性的第一引物对进行第一级PCR反应扩增，从而获得一级扩增产物P1；将第一扩增产物P1从LcnPCR第一次反应空间转移至反应管的LcnPCR第二次反应空间中，作为第二级PCR反应的模板；在LcnPCR第二次反应空间中，通过HPV特异性的第二引物对进行第二级PCR反应扩增，从而获得二级扩增产物P2；第二级PCR反应采用染料法，并监测融解曲线；如果融解曲线没有特异峰则说明该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的HPV序列与HPV标准序列进行比对鉴别出HPV的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则转至第三步；第三步、对二级扩增产物P2进行第三级PCR反应获得三级扩增产物P3，经二代测序确定样本所含HPV的各个亚型；其中，第二级PCR反应所用第二引物对的各引物末端含有便于第三级PCR反应加入样本标签的特定片段。2.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，其特征是，所述反应管内设有材质与反应管相同的薄膜，该薄膜将反应管的反应空间分成彼此独立的LcnPCR第一次反应空间和LcnPCR第二次反应空间。3.根据权利要求2所述的一种人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，其特征是，所述反应管的管壁外部设有与LcnPCR第一次反应空间对应的凹向管内的凹记号。4.根据权利要求3所述的一种人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，其特征是，薄膜高度为反应管封闭后内部空间高度的五分之四；反应管内放置的磁珠采用44DC钢球,直径1mm；反应管外配套的磁力棒采用钕铁硼特强磁铁棒。5.根据权利要求1至4任一项所述的一种人乳头瘤病毒HPV型别...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思，洪国藩，周恬君，朱明星，贺乐欣，李小洋，玛莎，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：