一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用，属于猴痘核酸检测领域。该试剂盒包括引物qPCR

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及猴痘核酸检测领域，具体涉及一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用。

技术介绍

[0002]猴痘(Monkeypox，MPX)是由猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)引起的人畜共患性疾病。MPXV由双链DNA和外膜组成，是痘病毒科(包括牛痘病毒、天花病毒和其他痘病毒)正痘病毒属(OPXV)的成员，主要分为西非群株和刚果盆地群株。除了通过猴子传播外，该病毒还通过冈比亚袋鼠和非洲松鼠等啮齿动物传播。MPXV也能感染人类，但其感染率和死亡率明显低于天花病毒。MPXV主要通过直接接触感染者的体液、患病组织或呼吸道飞沫传播。患者会出现头痛、发热、淋巴结肿大以及类似水疱状皮疹等症状。潜伏期通常为7至14天，症状持续时间2至4周，致死率在0％～11％之间，绝大多数患者可康复。目前还没有针对MPX的针对性治疗方案，因此，准确的检测对于早期发现病例、快速鉴别诊断和控制病毒传播至关重要。
[0003]目前可以通过病毒分离和培养技术、电子显微镜活检、痘病毒抗原的免疫组织化学染色以及抗正痘病毒IgM和IgG抗体的血清学研究来检测MPXV。然而，上述诊断测试既是不确定的，也需要冗长的培养过程。根据病毒的流行病学特征和监测需要，MPXV感染的确认最适合通过病毒核酸分子扩增，特别是聚合酶链反应(PCR)技术可以快速检测MPXV DNA。各种诊断标本可直接从皮疹中获得，包括皮肤、水疱体液和结痂。在短时间内对痘病毒可以进行早期筛查诊断。
[0004]聚合酶链式反应技术(PCR)被专利技术以来，由于其简单、廉价、可靠、快速、灵敏的优质，PCR可能是分子生物学中使用最广泛的技术。qPCR是由PCR技术发展出来的一种技术，通过在DNA扩增过程中，以荧光信号侦测每次PCR循环后产物总量的方法，不单有PCR的快速、灵敏，更有专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势。TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5
’
端偶联发光基团，3
’
端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5
’‑3’
外切酶活性，遇到探针会从5
’
端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。qPCR技术作为猴痘病毒的常规诊断首选方法，具有快速、经济、高效、减少实验室差异和样本污染等多重优势。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂盒及应用。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术的第一方面，涉及一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，包括：
[0008]引物qPCR
‑
F，序列为SEQ ID NO.2；
[0009]引物qPCR
‑
R，序列为SEQ ID NO.3；以及
[0010]探针qPCR
‑
P，序列为SEQ ID NO.4。
[0011]可选地，所述探针qPCR
‑
P的5
’
端由FAM修饰，qPCR
‑
P的3
’
端由BHQ1修饰
[0012]本专利技术的第二方面，涉及一种试剂盒，包括：
[0013]上述的试剂；
[0014]反应试剂；以及
[0015]目标DNA，序列为SEQ ID NO.1。
[0016]可选地，所述反应试剂包括Tris、KCl、MbCl2、dNTPs与Taq酶。
[0017]本专利技术的第三方面，涉及非诊断目的上述的试剂，或者上述的试剂盒在检测体外样本是否含有猴痘病毒中的应用。
[0018]可选地，所述应用包括以下步骤：
[0019]根据目标DNA设计DNA引物和探针；
[0020]加入反应试剂、引物与探针，进行核酸扩增；
[0021]扩增后进行变性与退火，观察扩增曲线。
[0022]可选地，所述的核酸扩增步骤中，引物qPCR
‑
F、引物qPCR
‑
R以及探针qPCR
‑
P的浓度均为10μmol/L。
[0023]可选地，所述退火温度为56℃。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术的猴痘检测技术作为猴痘病毒的常规诊断首选方法，具有快速、经济、高效、减少实验室差异和样本污染等多重优势。
附图说明
[0026]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0027]图1为一种用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR试剂盒及应用方法的示意图。A表示实时荧光定量PCR检测方法的具体步骤。
[0028]图2为实施例1中ABI
‑
7500和琼脂糖凝胶电泳技术验证用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术的反应条件优化结果。图2a为引物浓度的优化图，从左至右分别为2μM
‑
12μM梯度以及阴性对照结果。图2b为探针浓度的优化图，从左至右分别为2μM
‑
12μM梯度以及阴性对照结果。图2c为退火温度优化图，从左至右分别为50℃
‑
58℃梯度以及阴性对照结果。检测结果显示，qPCR
‑
R、qPCR
‑
F加入量均为8μM、探针加入量为8μM、退火温度为56℃时反应效果最佳。且ABI
‑
7500结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。
[0029]图3为实施例2中用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法灵敏度分析结果。从左至右依次为5.0
×
107copy/mL到5.0
×
101copy/mL的梯度范围以及阴性对
照。检测结果显示最低检测限＜500copies/μL，且ABI
‑
7500结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。
[0030]图4为实施例3中用于检测猴痘病毒核酸的实时荧光定量PCR技术及应用方法特异性分析结果。从左至右依次为猴痘假病毒(MPX PV)、牛痘假病毒(CPX PV)、单纯疱疹病毒(HS PV)、水痘假病毒(VZ PV)、巨细胞假病毒(HCM PV)及阴性对照。检测结果显示扩增结果均未观本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，包括：引物qPCR
‑
F，序列为SEQ ID NO.2；引物qPCR
‑
R，序列为SEQ ID NO.3；以及探针qPCR
‑
P，序列为SEQ ID NO.4。2.根据权利要求1所述的用于检测猴痘病毒的实时荧光定量PCR试剂，其特征在于，所述探针qPCR
‑
P的5
’
端由FAM修饰，qPCR
‑
P的3
’
端由BHQ1修饰。3.一种试剂盒，包括：权利要求1或2所述的试剂；反应试剂；以及目标DNA，序列为SEQ ID NO.1。4.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴国球，范小波，古丽乃扎尔，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：