一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法，包括如下步骤：步骤一：待检样品前处理；步骤二：配置反应液：包括ddPCR Supermix for Probes、上下游引物、探针、模板和ddH2O；所述上下游引物和探针；步骤三：制备微滴；步骤四：PCR扩增，将反应板放入伯乐PCR仪中进行扩增。步骤五：检测微滴，PCR反应后，将样本板在电脑上设置成功后，放入QX200Droplet微滴分析仪中，进行微滴分析检测，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。本发明专利技术不需要建立标准曲线，可以进行绝对定量；对ORSV的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，既能够精确地检测到单拷贝甚至是低浓度混杂样品，又可以显著降低体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰。和抑制物对反应的干扰。和抑制物对反应的干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体地说，涉及一种齿兰环斑病毒的检测方法。

技术介绍

[0002]齿兰环斑病又称尖兰环斑病。在我国的福州、成都、上海基地均有分布，引起齿兰环斑病的病原为齿兰环斑病毒odontolossumringspoevims,ORSV。此病毒感染植株后，在建兰上产生花叶状，在卡特兰上产生坏死斑，在龄兰上形成环斑。该病毒传播的主要途径是汁液、园艺操作过程和工具。对植物构成极大危害。
[0003]现有技术中对齿兰环斑病毒的检测方法，主要是基于血清学和分子生物学特征进行的，然而该检测方法存在诸多缺陷。
[0004]数字PCR(也可称单分子PCR)一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。数字PCR的定量方法不依赖于扩增曲线的循环阈值，因此不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，实现绝对定量分析。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，将数字PCR应用到齿兰环斑病毒的检测中，提供一种不需要内参以及标准品，可以定量检测齿兰环斑病毒的数字PCR定量检测方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法，包括如下步骤：
[0008]步骤一：待检样品前处理；
[0009]步骤二：配置反应液：包括ddPCRSupermixforProbes、上下游引物、探针、模板和ddH2O；
[0010]所述上下游引物为ORSV
‑
F1/ORSV
‑
R1：
[0011]ORSV
‑
F15'ATCAACCTTTGTACCAATTCTCTG3'
[0012]ORSV
‑
R15'CAGGGAACCTACTGGTCAAAG3'
[0013]所述探针为ORSV
‑
P1:
[0014]ORSV
‑
P1AACACAACAAGCTC5
’
FAM3
’
MGB；
[0015]步骤三：制备微滴：
[0016](1)将一个新的DG8cartridge放入holder中；
[0017](2)将反应液加入到DG8cartridge中间一排的8个孔中；
[0018](3)在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入微滴生成油(DGOil)，同样不能有空着的孔；
[0019](4)盖上胶垫；
[0020](5)将以上holder轻轻地平稳放置于QX200微滴生成仪中，生成微滴；
[0021](6)微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移到96孔板中，结束后将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜得到反应板；
[0022]步骤四：PCR扩增：
[0023]将反应板放入伯乐PCR仪中进行扩增。
[0024]步骤五：检测微滴，PCR反应后，将样本板在电脑上设置成功后，放入QX200Droplet微滴分析仪中，进行微滴分析检测，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。
[0025]作为优选的，在上述的基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法中，步骤四所述扩增反应程序为：
[0026]预变性：温度95℃，10min，1个循环；
[0027]变性：温度94℃，30s，退火/延伸；温度60℃，60s，共40个循环；
[0028]结束反应：温度98℃，10min，1个循环；保存，温度4℃。
[0029]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0030]本专利技术不需要建立标准曲线，可以进行绝对定量；对ORSV的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，既能够精确地检测到单拷贝甚至是低浓度混杂样品，又可以显著降低体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰。
附图说明
[0031]图1为RNA电泳检测结果图；
[0032]注：Marker为DNAMarker，其只为检测基因组污染，并不代表RNA条带大小；
[0033]图2为基因CP(ORSV)
‑
F1/CP(ORSV)
‑
R1的扩增曲线；
[0034]图3为基因CP(ORSV)
‑
F1/CP(ORSV)
‑
R1的溶解曲线；
[0035]图4为基因CP(ORSV)
‑
F2/CP(ORSV)
‑
R2扩增曲线；
[0036]图5为基因CP(ORSV)
‑
F2/CP(ORSV)
‑
R2溶解曲线；
[0037]图6为基因CP(ORSV)
‑
F3/CP(ORSV)
‑
R3扩增曲线；
[0038]图7为基因CP(ORSV)
‑
F3/CP(ORSV)
‑
R3溶解曲线；
[0039]图8为基因CP(ORSV)(引物ORSV
‑
F1/ORSV
‑
R1/ORSV
‑
P1)扩增曲线；
[0040]图9为ORSV阳性10倍梯度稀释模板，102稀释的检测结果图；
[0041]图10为ORSV阳性10倍梯度稀释模板，103稀释的检测结果图；
[0042]图11为ORSV阳性10倍梯度稀释模板，104稀释的检测结果图；
[0043]图12为CMV阳性的检测结果图；
[0044]图13为CymMV阳性的检测结果图；
[0045]图14为未知样品1的检测结果图；
[0046]图15为未知样品2的检测结果图；
[0047]图16为未知样品3的检测结果图；
[0048]图17为未知样品4的检测结果图；
[0049]图18为未知样品5的检测结果图；
[0050]图19为未知样品6的检测结果图；
[0051]图20为未知样品7的检测结果图；
[0052]图21为未知样品8的检测结果图；
[0053]图22为未知样品9的检测结果图；
[0054]图23为未知样品10的检测结果图；
[0055]图24为未知样品11的检测结果图；
[0056]图25为未知样品12的检测结果图；
[0057]图26为未知样品13的检测结果图
[0058]图27为未知样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR定量检测齿兰环斑病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一：待检样品前处理；步骤二：配置反应液：包括ddPCRSupermixforProbes、上下游引物、探针、模板和ddH2O；所述上下游引物为ORSV
‑
F1/ORSV
‑
R1：ORSV
‑
F15'ATCAACCTTTGTACCAATTCTCTG3'ORSV
‑
R15'CAGGGAACCTACTGGTCAAAG3'所述探针为ORSV
‑
P1:ORSV
‑
P1AACACAACAAGCTC5
’
FAM3
’
MGB；步骤三：制备微滴：(1)将一个新的DG8cartridge放入holder中；(2)将反应液加入到DG8cartridge中间一排的8个...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐匆，郑芝波，黄皓，黄晓彦，李昀哲，陈彦，罗华建，胡珊，梁卫驱，
申请(专利权)人：东莞市农业科学研究中心，
类型：发明
国别省市：