一种检测黄热病毒的引物探针组合和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测黄热病毒的引物探针组合和试剂盒，涉及病毒检测领域。所述检测黄热病毒的引物探针组合包括外围引物对、探针和扩增引物对。特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；可同时满足高通量和低通量的样品检测；整个反应过程不需要复杂的仪器。应过程不需要复杂的仪器。应过程不需要复杂的仪器。

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄热病毒的引物探针组合和试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒检测领域，特别是涉及一种检测黄热病毒的引物探针组合和试剂盒。

技术介绍

[0002]黄热病病毒(YFV)是一种节肢动物传播的病毒，属于黄病毒科，黄病毒属。它是最重要的非洲和南美洲热带地区的人类病原体之一，也是一种起源于非洲并传入世界的古老虫媒病毒。病毒基因组由单一的链状正链RNA，长度约为11kb由10个基因组成，三个结构基因(E、prM和E)和七个非结构性(NS)即NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4、NS4b和NS5。它编码十个同名的蛋白质，以及开放阅读框两侧是两个非编码区(NCR)。在非洲，YFV主要通过伊蚊传播，包括非洲伊蚊、白斑伊蚊和辛普森伊蚊等。
[0003]大约85％的YFV感染是无症状或轻微的，特点是突然发烧、发冷、严重头痛，背痛，全身关节痛，恶心，呕吐，疲劳，和虚弱，临床表现类似于登革热或流感。经典重度图片在15％左右被检测到受感染的人；这些患者出现发烧、黄疸、出血素质，并最终出现休克和呼吸衰竭多器官功能衰竭，尤其是肝肾功能衰竭，导致病死率(CFR)约为50％。这种病主要在热带美洲的城市地区出现，也在亚马逊地区和巴西中部地区的森林地区由于易感(未免疫)人群接触病毒在流行地区出现。
[0004]目前应用于黄热病毒核酸检测的技术有很多种，这些常规检查方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题。PCR技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用。进口诊断试剂则由于采购供货周期长，价格昂贵，基层单位难于常规应用。而黄热病高发区主要集中于农村、边远地区及贫穷落后国家，世卫组织调查认为在全世界黄热病毒病患者或生活在黄热病毒高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。因此，开发简便、快速、准确、经济，尤其适宜于基层单位推广使用的黄热病毒快速诊断试剂成了各国企业研究的重点。
[0005]近年来的发展起来针对黄热病毒的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR,FQ
‑
PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在黄热病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前黄热病毒检测的主要方法，目前国内市场上尚未有关于黄热病毒检测的引物探针组合。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种检测黄热病毒的引物探针组合和试剂盒，本专利技术的检测黄热病毒的引物探针组合特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1.5小时；可同时满足高通量和低通量的样品检测，且整个反应过程不需要复杂的仪器。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种检测黄热病毒的引物探针组合，包括外围引物对、探针和扩增
引物对；
[0009]所述外围引物对为正向外围引物和反向外围引物，所述正向外围引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向外围引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0010]所述探针为正向5
’
端Biotin标记探针和反向5
’
端FITC标记人工探针，所述正向5
’
端Biotin标记探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向5
’
端FITC标记人工探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0011]所述扩增引物对为正向扩增引物和反向扩增引物，所述正向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述反向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0012]本专利技术还提供了一种检测黄热病毒的试剂盒，包括扩增反应液，所述扩增反应液中含有权利要求1所述的引物探针组合。
[0013]优选的，所述扩增反应液每16μl中正向外围引物和反向外围引物的含量都为0.05μmol；
[0014]所述扩增反应液每16μl中正向5
’
端Biotin标记探针和反向5
’
端FITC标记人工探针的含量都为0.5μmol；
[0015]所述扩增反应液每16μl中正向扩增引物和反向扩增引物的含量都为0.5μmol。
[0016]优选的，所述扩增反应液还包括1
×
Thermol buffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst核酸聚合酶和无菌双蒸水。
[0017]优选的，所述扩增反应液每16μl中1
×
Thermol buffer的含量为2μl；
[0018]所述1
×
Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris
‑
HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4和质量浓度为0.1％的Triton X
‑
100，所述
×
Thermol buffer的pH 8.8。
[0019]优选的，所述扩增反应液每16μl中MgSO4的含量为6mmol；
[0020]所述扩增反应液每16μl中dNTPs的浓度为0.4mmol；
[0021]所述扩增反应液每16μl中Bst核酸聚合酶的酶活为10U；
[0022]优选的，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、阳性对照和阴性对照。
[0023]优选的，所述阳性对照为含有黄热病毒NS1基因片段的质粒。
[0024]优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。
[0025]优选的，所述试剂盒还包括检测所需的试纸条。
[0026]本专利技术提供的试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg
2+
浓度，反应温度等的优化，并将本专利技术与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了黄热病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测黄热病毒的要求。
[0027]本专利技术的有益效果为：
[0028]1、特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；
[0029]2、反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；
[0030]3、整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；
[0031]4、可同时满足高通量和低通量的样品检测；
[0032]5、整个反应过程不需要复杂的仪器。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0034]图1为基于发夹式结构的核酸恒温扩增的反应原理图；
[0035]图2为本专利技术试剂盒用于检测黄热病毒的灵敏度。
具体实施方式
[0036]本专利技术提供了一种检测黄热病毒的引物探针组合，包括外围引物对、探针和扩增引物对；
[0037]所述外围引物对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测黄热病毒的引物探针组合，其特征在于，包括外围引物对、探针和扩增引物对；所述外围引物对为正向外围引物和反向外围引物，所述正向外围引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向外围引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为正向5
’
端Biotin标记探针和反向5
’
端FITC标记人工探针，所述正向5
’
端Biotin标记探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向5
’
端FITC标记人工探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述扩增引物对为正向扩增引物和反向扩增引物，所述正向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述反向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。2.一种检测黄热病毒的试剂盒，其特征在于，包括扩增反应液，所述扩增反应液中含有权利要求1所述的引物探针组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液每16μl中正向外围引物和反向外围引物的含量都为0.05μmol；所述扩增反应液每16μl中正向5
’
端Biotin标记探针和反向5
’
端FITC标记人工探针的含量都为0.5μmol；所述扩增反应液每16μl中正向扩增引物和反向扩增引物的含量都为0.5μmol。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阳，唐晓宇，陈琳，田玲玲，孙涛，陈瑞，陈峰，杨国平，
申请(专利权)人：江苏国际旅行卫生保健中心徐州分中心，
类型：发明
国别省市：