人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒，所述引物探针组合物包括引物组和探针组，所述引物探针组合物以人乳头瘤病毒晚期区的结构蛋白L1基因的特异性片段作为靶标，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～38所示的核苷酸序列；所述探针组包括如SEQ ID NO.39～57所示的核苷酸序列。本发明专利技术可以实现一管即可检测人乳头瘤病毒感染的同时对其进行部分分型，耗时较短，操作便捷，并且具有较高的灵敏度。的灵敏度。的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(Human
‑
papilloma
‑
virus,
‑
HPV)属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属；HPV是无包膜的、嗜上皮的、双链的DNA病毒，以物种特异性的方式感染各种高等脊椎动物的感染鳞状上皮细胞(粘膜和皮肤上皮)，并诱导细胞增殖。宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。宫颈癌在中国15～44岁女性各癌症发病率中居第二位，死亡率位居第三位。几乎所有宫颈癌病例都与HPV感染有关，HPV被认为是导致90％以上的肛门癌和宫颈癌，约70％的阴道癌和外阴癌以及超过60％的阴茎癌的原因。人乳头瘤病毒主要通过性活动传播，但人们也可以通过皮肤接触感染，大约80％的人会在他们生命中的某个时刻感染HPV，但大多数情况下，免疫系统会清除病毒，但持续感染可能导致癌前病变。因此定期检测宫颈脱落细胞中HPV病毒是否持续性感染在早期筛查、对于医生诊断用药、帮助病人根除病症和预后诊断具有重要意义。
[0003]目前对于人乳头瘤病毒的核酸检测方法主要包括：Northern blot、Southern blot、杂交捕获、原位杂交、酶切信号放大法、PCR和DNA测序等。
[0004]对于HPV基因组的分析，Southernr/>‑
blot被认为是评估HPV基因组的黄金标准，虽然Southern blot对DNA分子的检测和Northern blot对RNA分子的检测，都能做到非常精确，可以产生高质量的信息，但是实验时间非常长，并且需要大量高度纯化的核酸。此外，它们需要保存完好的完整分子，因此不能在所有生物标本上进行，特别是那些来自于需要经常检测的组织的标本。另外，它们在技术操作上也很麻烦，并不适合大规模人口研究。
[0005]杂交捕获技术是目前国际上使用比较广泛，比较成熟的HPV检测技术。其原理是利用放大抗体捕获的信号和检测化学发光信号。HC2 HPV DNA的技术原理是第二代杂交捕获，本质上是采用RNA探针进行靶标捕获，利用抗体和酶进行信号放大，但该法主要限制也在于RNA探针与HPV
‑
DNA靶标之间的交叉反应，会降低反应特异性。
[0006]原位杂交是一种在具有保守形态的细胞或组织切片中鉴定特定核苷酸序列的技术，该技术允许对生物标本中的靶基因组进行精确的空间定位。原位杂交的一大优点是它可以应用于常规固定和处理的组织，这克服了该方法相对较低的分析灵敏度。但是其缺点也很明显：由于探针交叉杂交而导致HPV分型错误、技术复杂和对完整组织样本的要求高，这些缺点使得原位杂交不足以进行大规模的流行病学调查。
[0007]酶切信号放大法由Cleavase酶特异性识别并切割目标DNA分子结构，通过识别目标DNA与信号放大两个步骤，直接检测特定核苷酸序列，无需进行基因扩增，缺点是成本高。
[0008]通过PCR进行人乳头瘤病毒检测方法主要有：PCR毛细管电泳法、PCR反向点杂交法、PCR溶解曲线法和PCR荧光探针法。
[0009]PCR毛细管电泳法就是利用毛细管电泳来对PCR的产物进行分析，但是该方法最大的缺点是无法对DNA进行分型检测。中国专利“CN109112184A一种HPV基因芯片及其制备方法和应用”采用了PCR反向点杂交法，PCR
‑
反向点杂交即将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测；PCR溶解曲线法需要先进行PCR扩增，扩增后进行熔解曲线分析。但是该方法耗时长，单探针Tm值变化较小，且需要高分辨率仪器，对仪器要求苛刻。PCR荧光探针法，检测方便，经过调整后可以进行快速PCR检测，大大缩短了检测时间，目前大多数产品均是以此方法开发，但是各个公司的检测靶标、检测灵敏度都不相同。
[0010]DNA测序是RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为cDNA后使用DNA测序的方法进行测序。HPV作为DNA病毒，不需要逆转录成cDNA再进行测序，可以直接进行检测。虽然目前测序技术准确且快速，但是成本居高不下，时间周期长，难以大规模筛查，不适合医院对病人进行诊断筛查。

技术实现思路

[0011]有鉴于此，本专利技术的目的是提供人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒，实现一管即可检测人乳头瘤病毒感染的同时对其进行部分分型，耗时较短，操作便捷，并且具有较高的灵敏度。
[0012]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0013]本专利技术的第一方面在于提供了一种人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物，所述引物探针组合物包括引物组和探针组，所述引物探针组合物以人乳头瘤病毒晚期区的结构蛋白L1基因的特异性片段作为靶标，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～38所示的核苷酸序列；所述探针组包括如SEQ ID NO.39～57所示的核苷酸序列。
[0014]结合第一方面，在一些实施方式中，检测的所述人乳头瘤病毒基因分型是HPV
‑
16、HPV
‑
18、HPV
‑
26、HPV
‑
35、HPV
‑
39、HPV
‑
45、HPV
‑
51、HPV
‑
53、HPV
‑
56、HPV
‑
59、HPV
‑
66、HPV
‑
68a、HPV
‑
68b、HPV
‑
73、HPV
‑
82、HPV
‑
31、HPV
‑
33、HPV
‑
52、HPV
‑
58；
[0015]针对HPV
‑
16设计的上游引物为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；
[0016]针对HPV
‑
18设计的上游引物为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
[0017]针对HPV
‑
26设计的上游引物为如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列；
[0018]针对HPV
‑
35设计的上游引物为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物，所述引物探针组合物包括引物组和探针组，其特征在于，所述引物探针组合物以人乳头瘤病毒晚期区的结构蛋白L1基因的特异性片段作为靶标，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～38所示的核苷酸序列；所述探针组包括如SEQ ID NO.39～57所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物，其特征在于，检测的所述人乳头瘤病毒基因分型是HPV
‑
16、HPV
‑
18、HPV
‑
26、HPV
‑
35、HPV
‑
39、HPV
‑
45、HPV
‑
51、HPV
‑
53、HPV
‑
56、HPV
‑
59、HPV
‑
66、HPV
‑
68a、HPV
‑
68b、HPV
‑
73、HPV
‑
82、HPV
‑
31、HPV
‑
33、HPV
‑
52、HPV
‑
58；针对HPV
‑
16设计的上游引物为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
18设计的上游引物为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
26设计的上游引物为如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
35设计的上游引物为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
39设计的上游引物为如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
45设计的上游引物为如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
51设计的上游引物为如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
53设计的上游引物为如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
56设计的上游引物为如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
59设计的上游引物为如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，对应设计的下游引物为如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；针对HPV
‑
66设计的上游引物为如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，对应设计的下游引
物为如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，对应设计的荧光探针为如SEQ ID NO.49所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：左云国，许浩，王丽娟，张明俊，李文艺，
申请(专利权)人：重庆新赛亚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：