提高RNA分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法技术

本发明专利技术涉及提高RNA分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法。具体而言，本发明专利技术提供一种RNA分子的制备方法，所述方法包括在起始RNA分子的poly(A)尾的3

【技术实现步骤摘要】
提高RNA分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法


[0001]本专利技术涉及提高RNA分子的胞内翻译效率和稳定性的方法。

技术介绍

[0002]体外合成的mRNA通过电穿孔、脂质体等递送技术被递送到细胞内，可用于在细胞水平和动物体内翻译表达任何天然或非天然的蛋白质产物，包括微生物多肽抗原、肿瘤抗原多肽的串联物、抗体、嵌合抗原受体、天然及突变形式的酶和细胞因子等。目前，利用体外合成的mRNA在细胞内表达蛋白质的方法已被广泛应用于多种传染病疫苗的开发，如已获批的新冠疫苗、进入三期临床试验的流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗和巨细胞病毒疫苗等。同时，mRNA技术也在肿瘤免疫治疗和罕见病治疗领域崭露头角，目前有多个mRNA药物进入一期或二期临床试验。
[0003]大量研究证明优化mRNA分子结构、引入核苷酸修饰和改进纯化方法等，可极大地提升mRNA的稳定性和翻译效率、降低mRNA免疫原性〔Pardi,N.,Hogan,M.J.,Porter,F.W.,&Weissman,D.(2018).mRNA vaccines
‑
a new era in vaccinology.Nature reviews.Drug discovery,17(4),261
–
279〕。Katalin Karik
ó
与Drew Weissman因在mRNA分子中创新地引入假尿嘧啶核苷(pseudouridine，ψ)修饰而摘得2021年的“诺奖风向标”拉斯克奖。但现在已应用于mRNA技术的核苷酸修饰，例如假尿嘧啶核苷(ψ)和5
‑
甲基胞嘧啶核苷(5
‑
methylcytosine，m5C)修饰，都是针对mRNA poly(A)以外的区域或整条mRNA〔Pardi,N.,Hogan,M.J.,Porter,F.W.,&Weissman,D.(2018).mRNA vaccines
‑
a new era in vaccinology.Nature reviews.Drug discovery,17(4),261
–
279〕。poly(A)作为mRNA分子3
’
端的重要结构，在mRNA的翻译效率和稳定性方面发挥了关键作用〔Passmore,L.A.,&Coller,J.(2021).Roles of mRNA poly(A)tails in regulation of eukaryotic gene expression.Nature reviews.Molecular cell biology,10.1038/s41580
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021
‑
00417
‑
y.Advance online publication〕。但目前已报道的研究仅止步于优化poly(A)的长度，poly(A)中引入核苷酸修饰对于mRNA的稳定性和翻译效率的影响尚未得到充分探索。
[0004]在核苷酸修饰中，除了假尿嘧啶核苷(ψ)修饰这样的碱基修饰，还有针对磷酸基、糖基的修饰，例如以硫代磷酸(phosphorothioate，PS)修饰为代表的磷酸基修饰和以锁核酸(locked nucleic acid，LNA)修饰、2
’
甲氧基(2
’‑
O
‑
Methyl，2
’
OMe)修饰、2
’
氟代(2
’‑
Fluoro，2
’
F)修饰为代表的糖基修饰。这些修饰能极大地提高RNA的稳定性，并已经成功应用于已上市的多款反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)药物和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)药物〔Duffy,K.,Arangundy
‑
Franklin,S.,&Holliger,P.(2020).Modified nucleic acids:replication,evolution,and next
‑
generation therapeutics.BMC biology,18(1),112〕。这些核苷酸修饰是否能用于合成mRNA并提高mRNA的蛋白质表达效率，尚未得到充分研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面提供一种RNA分子的制备方法，所述方法包括在起始RNA分子的poly(A)尾的3
’
端添加由修饰腺苷酸和任选的未修饰腺苷酸组成的修饰poly(A)序列的步骤。
[0006]在一个或多个实施方案中，所述方法用于制备翻译效率和/或稳定性提高的RNA分子。
[0007]在一个或多个实施方案中，所述poly(A)尾为长度为30
‑
250个、优选50
‑
200个、更优选60
‑
200个、更优选60
‑
150个连续的含有未修饰腺苷酸并任选含有修饰腺苷酸的腺苷酸序列1，所述修饰poly(A)序列为长度为1
‑
250个、优选10
‑
250个、更优选20
‑
200个、更优选30
‑
200个核苷酸的腺苷酸序列2；优选地，所述腺苷酸序列2中至少5％、优选10
‑
100％、更优选20
‑
100％、更优选50
‑
100％的核苷酸是修饰的腺苷酸。
[0008]在一个或多个实施方案中，采用连接反应或聚合反应在所述起始RNA分子的所述poly(A)尾3
’
端添加所述修饰poly(A)序列。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述连接反应中，使用RNA连接酶将所述修饰poly(A)序列与所述poly(A)尾连接；优选地，所述修饰poly(A)序列的5
’
端具有5
’
P修饰，3
’
端具有选自以下的修饰：3
’
ddC、3
’
BHQ
‑
1、3
’
BHQ
‑
2、3
’
MGB、3
’
Dabcul、3
’6‑
TAMRA、3
’6‑
FAM、3
’
CY5、3
’
CY3、3
’6‑
ROX、3
’
inverted dT、3
’
Biotin、3
’
Biotin
‑
TEG、3
’
Amino modified C7、3
’
Phosphate、3
’
Digoxigenin、3
’
Thiol mod本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.RNA分子的制备方法，其特征在于，所述方法包括在起始RNA分子的poly(A)尾的3
’
端添加由修饰腺苷酸和任选的未修饰腺苷酸组成的修饰poly(A)序列的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一项或多项特征：(1)所述方法用于制备翻译效率和/或稳定性提高的RNA分子；(2)所述poly(A)尾为长度为30
‑
250个、优选50
‑
200个、更优选60
‑
200个、更优选60
‑
150个连续的含有未修饰腺苷酸并任选含有修饰腺苷酸的腺苷酸序列1，所述修饰poly(A)序列为长度为1
‑
250个、优选10
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250个、更优选20
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200个、更优选30
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200个核苷酸的腺苷酸序列2；优选地，所述腺苷酸序列2中至少5％、优选10
‑
100％、更优选20
‑
100％、更优选50
‑
100％的核苷酸是修饰的腺苷酸；(3)采用连接反应或聚合反应在所述起始RNA分子的所述poly(A)尾3
’
端添加所述修饰poly(A)序列；优选地，所述连接反应中，使用RNA连接酶将所述修饰poly(A)序列与所述poly(A)尾连接；优选地，所述修饰poly(A)序列的5
’
端具有5
’
P修饰，3
’
端具有选自以下的修饰：3
’
ddC、3
’
BHQ
‑
1、3
’
BHQ
‑
2、3
’
MGB、3
’
Dabcul、3
’6‑
TAMRA、3
’6‑
FAM、3
’
CY5、3
’
CY3、3
’6‑
ROX、3
’
inverted dT、3
’
Biotin、3
’
Biotin
‑
TEG、3
’
Amino modified C7、3
’
Phosphate、3
’
Digoxigenin、3
’
Thiol modifier C6 S
‑
S、3
’
Thiol modifier C3 S
‑
S、3
’
Spacer C3、3
’
Spacer C6、3
’
Spacer9、3
’
Spacer 18、3
’
dSpacer、3
’
Cholesteryl
‑
TEG和3
’
Ferrocene dT；优选地，所述聚合反应中，使用聚合酶或末端转移酶以修饰ATP及任选的未修饰ATP为底物，在起始RNA分子的所述poly(A)尾的3
’
端添加修饰腺苷酸和任选的未修饰腺苷酸；优选地，聚合反应的反应体系不含有未修饰ATP，或含有未修饰ATP时，修饰ATP和未修饰ATP的比例在1:19到19:1的范围内，如1:9到9:1或2:8到8:2；(4)所述起始RNA分子含有修饰的核苷酸；(5)所述方法还包括通过DNA模板制备具有所述poly(A)尾的起始RNA分子的步骤；优选地，所述DNA模板从5
’
端到3
’
端含有依次连接的启动子序列、5
’
非翻译区、Kozak序列、开放阅读框、3
’
非翻译区和poly(A)尾序列；更优选地，所述DNA模板在该poly(A)尾之后还直接连接有核酶序列；优选地，所述核酶是具有自剪切功能的核酶，优选选自HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶；(6)所述修饰腺苷酸中的修饰包括针对磷酸基的修饰和针对糖基的修饰；优选地，所述修饰选自硫代磷酸(PS)修饰、锁核酸(LNA)修饰、2
’
甲氧基(2
’
OMe)修饰和2
’
氟代(2
’
F)修饰；优选地，所述修饰腺苷酸为PS修饰的腺苷酸、LNA修饰的腺苷酸、PS修饰的腺苷酸与2
’
OMe修饰的腺苷酸的混合物或PS修饰的腺苷酸与2
’
F修饰的腺苷酸的混合物。3.一种mRNA分子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)使用DNA模板通过体外转录制备得到具有poly(A)尾的mRNA分子；和(2)以修饰ATP及任选的未修饰ATP为底物，使用聚合酶或末端转移酶在步骤(1)获得的mRNA分子的所述poly(A)尾的3
’
端添加修饰腺苷酸和任选的未修饰腺苷酸，从而制备得到所述mRNA分子。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述DNA模板从5
’
端到3
’
端含有依次连接的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴立刚，黎硕珂，张宏道，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：