【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种核酸检测试剂盒，属于分子生物学。
技术介绍
1、病毒是一种没有细胞结构的微生物，其结构包括蛋白质外壳和内部的遗传物质。从病毒的遗传物质分类，可以将病毒分为rna病毒和dna病毒。病毒蛋白质外壳的作用是保护病毒的遗传物质，将遗传物质注入其他生物的活细胞内进行繁殖，称为病毒的感染过程。目前，已知的病毒有200多种，人类的各种传染病有80％由病毒引起。
2、例如，sars-cov-2属β冠状病毒，sars-cov-2感染的临床症状主要以发热、干咳、乏力为主，重症多发生呼吸困难，快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。乙型肝炎病毒(hepatitis b)属嗜肝dna病毒科，是引起乙型肝炎的病原体，其临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等，病情重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可异常或持续异常。
3、及时对患者进行病毒核酸检测对患者的病情诊断和后续治疗十分关键。以编码病毒结构蛋白或遗传物质的核酸作为靶标的实时逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)检测方法是目前最常用的病毒定量检测方法。但是，实时逆转录聚合酶链式反应需要熟练的操作技术人员和基础设备，并且，样本得出结果的时间也很长，通常需要3个小时以上，效率较低。因此，亟需找到一种快速、准确和简单的核酸检测方法以用于病毒的定量检测。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于crispr/cas13a、hcr(杂交链式反应)
2、在本专利技术的一种实施方式中，所述茎环dna引物h0的茎长为5～30bp；所述核糖核苷酸序列的长度为1～15nt。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述茎环dna引物h0的茎长为13～16bp；所述核糖核苷酸序列的长度为2～5nt。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述核糖核苷酸序列插入在茎环dna引物h0的环状部分。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述茎环dna引物h0的茎长为13bp；所述核糖核苷酸序列的长度为5nt。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白和crrna的浓度比为0.5～4：0.5～4；所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白的浓度为0.1～800nm。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白和crrna的浓度比为1～2：1～2；所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白的浓度为5～100nm。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白和crrna的浓度比为1.5：1；所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白的浓度为50nm。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2形成双链后，供体标记和受体标记之间的距离为0～10个碱基。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2形成双链后，供体标记和受体标记之间的距离为2～5个碱基。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2形成双链后，供体标记和受体标记之间的距离为3个碱基。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述供体标记为羧基荧光素，所述受体标记为四甲基罗丹明；所述供体标记为异硫氰酸荧光素，所述受体标记为罗丹明；所述供体标记为alexa fluortm 488，所述受体标记为cy3。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸检测试剂盒还包括反应缓冲液和ddh2o。
14、本专利技术还提供了一种核酸检测方法，所述方法为：使用上述核酸检测试剂盒对待测样本进行检测，先将cas13a蛋白、crrna、插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环dna引物h0、带有供体标记的核酸发夹探针hp1和带有受体标记的核酸发夹探针hp2和待测样本混合后进行孵育，得到孵育液，然后将孵育液和ddh2o混合，得到混合液，再记录混合液在激光激发下的供体和受体荧光分子的荧光发射光谱，接着根据供体和受体荧光分子的荧光发射光谱强度，计算待测样本中靶标核酸的浓度。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述孵育的温度为17～47℃、时间为0.5～2h。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述待测样本为血液、唾液或水。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述靶标核酸为编码sars-cov-2s蛋白的核酸、编码sars-cov-2n蛋白的核酸或编码sars-cov-2orflab蛋白的核酸。
18、本专利技术还提供了上述核酸检测试剂盒或上述核酸检测方法在核酸检测中的应用。
19、本专利技术技术方案，具有如下优点：
20、本专利技术提供了一种基于crispr/cas13a、hcr(杂交链式反应)和fret(荧光共振能量转移)的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括cas13a蛋白、crrna、插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环dna引物h0、带有供体标记的核酸发夹探针hp1和带有受体标记的核酸发夹探针hp2，其中，所述cas13a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物，所述插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环dna引物h0能够在cas13a蛋白的反式切割活性下发生裂解形成线性dna片段，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2能够在茎环dna引物裂解而成的线性dna片段的引发下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2形成双链后，供体标记和受体标记之间能够引发fret效应。使用所述核酸检测试剂盒对待测样本中的靶标核酸进行定量检测时，在待测样本中有靶标核酸存在的情况下，cas13a/crrna的二元复合物特异性识别靶标核酸，cas13a的顺式和反式切割活性被激活，切割h0上插入或连接的单链rna(ssrna)，导致h0裂解成两个线性dna片段，其中一个线性dna片段是后续杂交链式反应所需的引发链，该引发链的释放触发后续的hcr扩增，依次打开hp1和hp2，形成很长的dsdna纳米线，dsdna纳米线中的供体和受体在空间上靠的很近，导致了它们之间的fret过程，此时，若供体为fam荧光基团、受体为tamra荧光基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包括Cas13a蛋白、crRNA、插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环DNA引物H0、带有供体标记的核酸发夹探针HP1和带有受体标记的核酸发夹探针HP2；所述Cas13a蛋白能够和crRNA结合形成靶向靶标核酸的二元复合物，所述插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环DNA引物H0能够在Cas13a蛋白的反式切割活性下发生裂解形成线性DNA片段，所述核酸发夹探针HP1和核酸发夹探针HP2能够在茎环DNA引物裂解而成的线性DNA片段的引发下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针HP1和核酸发夹探针HP2形成双链后，供体标记和受体标记之间能够引发FRET效应。
2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述茎环DNA引物H0的茎长为5～30bp；所述核糖核苷酸序列的长度为1～15nt。
3.如权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述茎环DNA引物H0的茎长为13～16bp；所述核糖核苷酸序列的长度为2～5nt。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核
5.如权利要求1～4任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒中，Cas13a蛋白和crRNA的浓度比为0.5～4：0.5～4；所述核酸检测试剂盒中，Cas13a蛋白的浓度为0.1～800nM。
6.如权利要求1～5任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒中，Cas13a蛋白和crRNA的浓度比为1～2：1～2；所述核酸检测试剂盒中，Cas13a蛋白的浓度为5～100nM。
7.如权利要求1～6任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸发夹探针HP1和核酸发夹探针HP2形成双链后，供体标记和受体标记之间的距离为0～10个碱基。
8.如权利要求1～7任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸发夹探针HP1和核酸发夹探针HP2形成双链后，供体标记和受体标记之间的距离为2～5个碱基。
9.一种核酸检测方法，其特征在于，所述方法为：使用权利要求1～8任一项所述的核酸检测试剂盒对待测样本进行检测，先将Cas13a蛋白、crRNA、插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环DNA引物H0、带有供体标记的核酸发夹探针HP1和带有受体标记的核酸发夹探针HP2和待测样本混合后进行孵育，得到孵育液，然后将孵育液和ddH2O混合，得到混合液，再记录混合液在激光激发下的供体和受体荧光分子的荧光发射光谱，接着根据供体和受体荧光分子的荧光发射光谱强度，计算待测样本中靶标核酸的浓度。
10.权利要求1～8任一项所述的核酸检测试剂盒或权利要求9所述的核酸检测方法在核酸检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包括cas13a蛋白、crrna、插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环dna引物h0、带有供体标记的核酸发夹探针hp1和带有受体标记的核酸发夹探针hp2；所述cas13a蛋白能够和crrna结合形成靶向靶标核酸的二元复合物，所述插入或连接有核糖核苷酸序列的茎环dna引物h0能够在cas13a蛋白的反式切割活性下发生裂解形成线性dna片段，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2能够在茎环dna引物裂解而成的线性dna片段的引发下发生杂交链式反应形成双链，并且，所述核酸发夹探针hp1和核酸发夹探针hp2形成双链后，供体标记和受体标记之间能够引发fret效应。
2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述茎环dna引物h0的茎长为5～30bp；所述核糖核苷酸序列的长度为1～15nt。
3.如权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述茎环dna引物h0的茎长为13～16bp；所述核糖核苷酸序列的长度为2～5nt。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核糖核苷酸序列插入在茎环dna引物h0的环状部分。
5.如权利要求1～4任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒中，cas13a蛋白和crrna的浓度比为0.5～4：0.5～4；所述核酸检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩坤，吴雪兰，李靖雯，李夷飞，刘涛，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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