充分提取贴壁细胞总蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及充分提取贴壁细胞总蛋白的方法，其包括将贴壁细胞进行超声裂解，其中，所述超声裂解的时间为2分30秒

【技术实现步骤摘要】
充分提取贴壁细胞总蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及一种充分提取贴壁细胞总蛋白的方法。

技术介绍

[0002]目前业内细胞总蛋白含量的测量主要是通过BCA法和考马斯亮蓝法为主。其中BCA法具有准确性高，检测速度快的特点。BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合生成绿色的BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质Cu
2+
还原为Cu
+
，工作试剂由原来的绿色变为紫色复合物(参见，Smith,P.K.,et al.(1985).Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal Biochem150:76
‑
85)。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
[0003]无论采用上述哪种方法，高效的细胞破碎都是准确测量蛋白含量的必要前提。当前，细胞破碎可采用机械破碎、化学和生物化学渗透以及物理渗透等方法。其中超声波破碎属于机械破碎，是指在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞结构损伤或破碎。损伤作用的强弱与超声的频率和功率密切相关。目前实验室中细胞蛋白提取常使用超声破碎细胞，但超声破碎细胞提取蛋白质的效果不足够好，为克服超声不够充分而导致收获的目的蛋白少而无法检测的问题，本领域技术人员常常需要大量富集细胞，将几个培养皿中的细胞富集在一起进行悬浮超声，最终达到富集蛋白的目的，以降低需要蛋白充分释放的要求。然而在细胞样本少的情况下，如研究从人体中获取的细胞中某蛋白的含量的情况下，如果想要精确评价单位数量的细胞中的某蛋白含量，使这些有限的细胞充分释放蛋白就显得尤为关键。
[0004]在提取细胞总蛋白的时候，细胞破碎的程度直接决定了我们测定的细胞总蛋白含量是否准确。超声波破碎导致细胞裂解后，细胞内总蛋白会向细胞外溢出。即使细胞发生破裂，但如果破裂的程度不够，会导致蛋白的包内滞留，导致总蛋白测量不够准确。另一方面，加大破碎的时间可以增大细胞破碎效率，但与此同时会产生大量的热，由此提高了蛋白溶剂的温度。有文献表明，较高的温度会使部分蛋白发生降解。长时间的破碎操作会影响蛋白含量测量的准确度。因此为了精确测定总蛋白含量，需要一种在保持较少破碎时间的基础上，可以高效破碎细胞的方法。
[0005]然而，现有技术当中使用的细胞悬浮超声的方法存在以下问题：第一，因常常需要大量的细胞样本，在样本量极少或难获取的情况下并不适用；第二，在超声的时候会非常容易出现温度过高的情况，使得蛋白变性，损失目的蛋白；第三，由于悬浮超声要使用的细胞样本量大，又要尽量避免温度过高，也反过来会导致超声不充分，蛋白提取不充分。
[0006]因此如何提高细胞超声效率尤为重要，特别是在细胞样本量少的情况下，能够使细胞中的蛋白更充分的释放，从而能够准确的测定单位细胞数量中蛋白含量成为了一个难题。

技术实现思路

[0007]针对贴壁细胞破碎不充分或者破碎时较高温度诱发的蛋白降解会导致蛋白含量测定不准确的问题，本专利技术人通过在细胞贴壁状态时进行超声破碎，优化超声参数，降低了超声波破碎时间，减少超声对细胞溶液作用而产生的热量，从而降低了溶液温度，达到提高蛋白溢出效率并降低蛋白降解的效果，最终更加充分的提取贴壁细胞的总蛋白，提高了贴壁细胞蛋白含量的测量精度。另外与细胞悬浮状态下的超声相比，本专利技术还省去了消化细胞的步骤，整体上缩短了细胞裂解的时间。超声悬浮的细胞容易出现泡沫，造成蛋白损失。而超声贴壁细胞在溶液中不易产生泡沫，进一步减少了蛋白损失。
[0008]具体地，本专利技术提供以下方面：
[0009]在一个方面，本专利技术提供提取贴壁细胞总蛋白的方法，其包括针对细胞在其贴壁状态下进行超声裂解，其中，所述超声裂解的条件如下：
[0010]时间为2分30秒
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3分钟30秒，优选2分40秒、2分50秒、3分钟、3分10秒或3分20秒，
[0011]功率为30W
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60W，包括但不限于35W、40W、45W、50W或55W，优选45W，
[0012]频率为15KHz
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30KHz，包括但不限于18KHz、19KHz、20KHz、21KHz、22KHz、23KHz、24KHz、25KHz或28KHz，优选21KHz，
[0013]振幅为25
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40μm，包括但不限于27μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、37μm或39μm，优选35μm，
[0014]超声开1
‑
5秒关4
‑
8秒，以此循环超声，包括但不限于超声开2秒关5秒，超声开3秒关6秒，或超声开4秒关7秒，优选超声开2秒关5秒。
[0015]在一个实施方案中，所述方法包括使贴壁细胞在直径小于100mm，优选直径小于60mm的培养器皿中贴壁培养并进行超声裂解。
[0016]在一个实施方案中，在所述超声裂解时所使用的细胞缓冲液为不含蛋白的细胞缓冲液。
[0017]在一个实施方案中，不含蛋白的细胞缓冲液为PBS。
[0018]在一个实施方案中，在所述超声裂解时培养皿中所用细胞缓冲液的液面高度大于1cm。
[0019]在一个实施方案中，所述超声在冰浴条件下进行。
[0020]在一个实施方案中，所述细胞为能够贴壁生长的细胞，包括但不限于成纤维细胞型细胞，如成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞或血管内皮细胞，上皮细胞型细胞，如皮肤上皮细胞、消化道上皮细胞、乳腺上皮细胞、肺泡上皮细胞、上皮性肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞)，游走细胞型细胞，如高分化鼻咽癌细胞，多形细胞型细胞，如神经细胞(如神经元细胞)。
[0021]在一个实施方案中，所述细胞进行超声时所用的细胞密度为铺满培养皿的50％
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100％，包括但不限于55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0022]在一个实施方案中，所述方法不包括在超声时的搅拌步骤。
[0023]在另一个方面，本专利技术提供精确测定贴壁细胞总蛋白的方法，其包括按照如上所述的提取贴壁细胞总蛋白的方法提取贴壁细胞的总蛋白，以及用BCA测定法测定总蛋白的浓度。
[0024]本文所述的“细胞缓冲液”为贴壁细胞超声时用来浸泡细胞的液体。在一些实施方
案中，所述细胞缓冲液选用PBS。
附图说明
[0025]图1显示MC3T3成骨细胞总蛋白浓度(5x105个细胞，13毫升PBS)；
[0026]图2显示MC3T3成骨细胞总蛋白含量(5x105个细胞)；
[0027]图3显示A375黑色素瘤细胞总蛋白浓度(5x105个细胞，13毫升PBS)；
[0028]图4显示A375黑色素瘤细胞总蛋白含量(5x10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提取贴壁细胞总蛋白的方法，其包括针对细胞在其贴壁状态下进行超声裂解，其中，所述超声裂解的条件如下：时间为2分30秒
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3分30秒，优选2分40秒、2分50秒、3分钟、3分10秒或3分20秒，功率为30W
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60W，例如35W、40W、45W、50W或55W，优选45W，频率为15KHz
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30KHz，例如18KHz、19KHz、20KHz、21KHz、22KHz、23KHz、24KHz、25KHz或28KHz，优选21KHz，振幅为25
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40μm，例如27μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、37μm或39μm，优选35μm，超声开1
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5秒关4
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8秒，以此循环超声，例如超声开2秒关5秒，超声开3秒关6秒，或超声开4秒关7秒，优选超声开2秒关5秒。2.如权利要求1所述方法，其包括使贴壁细胞在直径小于100mm，优选直径小于60mm的培养器皿中贴壁培养并进行超声裂解。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的方法，其中在所述超声裂解时所使用的细胞缓冲液为...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立秋，隋丽，孔福全，刘建成，龚毅豪，王巧娟，
申请(专利权)人：中国原子能科学研究院，
类型：发明
国别省市：