一种猴ips细胞系DT-M001建立及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能快速有效的将猴体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell,iPS)的制备系统。利用该培养系统，可以在短期内高效快速的制备猴iPS细胞。该系统的特征是所用体细胞来自猴体细胞，在猴耳源成纤维细胞培养条件下，其生物性质与人iPS极为类似。本发明专利技术发现利用组蛋白脱乙酰酶抑制剂进行诱导，可以加快猴iPS的重编程，且表达较高水平的多能性因子。本发明专利技术能高效诱导猴iPS细胞，并推动iPS的临床应用研究。究。究。

【技术实现步骤摘要】
一种猴ips细胞系DT
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M001建立及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及快速有效诱导性猴多能性干细胞的制备方法以及用于快速有效诱导性猴多能性干细胞的培养基。

技术介绍

[0002]从植入前的胚胎中第一次提取出人类胚胎干细胞似乎产生了一个新的潜在的细胞来源。许多退行性疾病的植入疗法。在成人体内，胚胎干细胞可以保持和扩展在体外未分化的状态，保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力。早在1981和1998年，猴和人的胚胎干细胞的建系成功，标志着再生医学的研究拉开了序幕。在未来的再生医学中，直接从患者体内产生多能干细胞是避免排斥反应的主要方法之一。最近证明4个多能因子足以将体细胞重新编程为胚胎样状态，被鉴定为诱导多能干细胞，迄今所获得的人IPS细胞与人胚胎干细胞在形态、增殖速率、基因表达谱、多能基因的表观遗传状态和多血统分化潜能等方面都有相似之处。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如，神经细胞、心肌细胞等:)已经具备了成熟的分化方法的检测标准，这不仅有可能为患者提供未来治疗所需的匹配产品线，从而消除免疫抑制的需求，而且还可以为药物筛选产生具有疾病特征的多能干细胞。然而，胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应用还面临许多技术和伦理问题。
[0003]2007年，日本和美国的科学家报道了可将KLF4、OCT4、SOX2和C
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MYC四种转录因子导入人的成纤维细胞，使其逆分化成具有胚胎干细胞特性的细胞，并将其命名为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPS cells)。在这篇发表在《Cell》杂志上的文章中，研究者选取了与胚胎干细胞信号转导相关的24个基因作为候选基因，感染人成纤维细胞，并进行基因组整合，分别以细胞形态学特点、胚胎干细胞关键基因表达，及畸胎瘤的形成等方面特点作为iPS的鉴定指标。最终确定了Oct4、Sox2、Klf4和c
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Myc这四个转录因子，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称iPS细胞。这种直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干细胞领域甚至整个生命科学领域都带来了概念性的革新。我们可以病人的体细胞为来源得到病人特异的iPS细胞，这种iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、组织和器官，用于疾病治疗。这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问题。自此，iPS细胞的诱导技术的出现也引起了人们对其生物医学应用的极大关注。
[0004]尽管iPS细胞的应用仍面临着两大问题：生物安全隐患和较低的诱导效率，近年来随着创新药物和新型医疗技术的发展，iPS细胞分化为免疫细胞(NK、T、巨噬细胞)、神经细胞、肝脏细胞、视网膜细胞等进行肿瘤、帕金森、重症肝衰竭、视网膜黄斑变性等疾病方面的治疗越来越成为一种可行性治疗手段。但由于缺乏遗传背景明确、实验方法稳定的实验动物(特别是猴)iPS的制备方法，iPS来源的细胞治疗技术的临床前安全性评价研究受到严重掣肘。因此，寻找能够提高猴iPS细胞制备方法和培养条件就成为非常重要的一环技术。
[0005]本专利技术针对现存技术中的问题，在猴iPS制备和培养方法上进行了广泛和深入的
研究，最终完成本专利技术。

技术实现思路

[0006]为了提高猴iPS细胞的制备效率，本专利技术提供了一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：
[0007]歩骤1，利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；
[0008]歩骤2，使用添加了蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；以及饲养层细胞的制备和传代；
[0009]歩骤3，观察和鉴定诱导性猴多能干细胞克隆。
[0010]优选地，所述方法进一歩包括将报告基因导入体细胞以此通过报告基因来指示所述诱导性猴多能干细胞的产生及其产生效率。且更优选地，所述报告基因为Oct4
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GFP或Nanog
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GFP，且更优选为Oct4
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GFP。
[0011]优选地，在歩骤1中，将所述干细胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式导入猴耳源成纤维细胞。
[0012]优选地，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子可选自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog,c
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Myc、L
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Myc、N
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Myc、Lin28和Esrrb中。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括Oct4、Sox2、Klf4和c
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Myc。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括Oct4、Sox2和Klf4。
[0013]优选地，在歩骤2中，所述蛋白脱乙酰酶抑制剂组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等；
[0014]优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为0.1
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40mM。更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为0.5
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20mM。且更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为1
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10mM。且更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为5
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10mM。且最优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为10mM。
[0015]更优选的，所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射线照射获得照射过的小鼠胚胎成纤维细胞；着用10ug/ml的丝裂霉素C处理2
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3小时，即获得饲养层细胞，液氮冻存。实验前1天复苏，接种至孔板或培养皿中备用。iMEF传代前，为接种了iMEF细胞的培养皿更换cmiPS培养液，在培养箱中预热至37℃。机械传代法：克隆生长至可传代时，PBS洗一次，更换培养液，在体视显微镜下用10μl的枪头将克隆划为约含5～10个细胞的小团块，用吸管将细胞团块转移并接种于含iMEF的六孔板内，后置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。于24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次；0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化传代法：克隆生长至可传代时，吸去旧培养液，PBS洗两次，37℃下加入0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化3～5min。镜下观察克隆中细胞变圆，边缘卷起时，吸走消化液，加入培养液终止消化，用1ml的移液器轻缓反复吹打至小团块状，使细胞充分脱壁。收集细胞悬液，1100rpm离心4min，调整细胞密度后接种于新的iMEF细胞的六孔板内，置于培养箱中继续培养。24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次。
[0016]歩骤2中使用的培养基可为为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有
15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离恒河猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；观察和鉴定诱导性猴多能干细胞克隆。2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一歩包括将报告基因导入猴耳源成纤维细胞，以此报告基因来指示所述诱导性猴多能干细胞的形成及其形成效率。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告基因为Oct4
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GFP或Nanog
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GFP,且优选为Oct4
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GFP。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子选自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog,c
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Myc、L
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Myc、N
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Myc、Lin28和Esrrb中。5.根据权利要求4所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c
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Myc，或者包括Oct4、Sox2和Klf4。6.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等。7.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述丁酸钠的工作浓度为0.1
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0.25μM，丙戊酸钠选为5
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10μM，ALK4/5/7抑制剂为5
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10μM。8.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中所述培养基为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、L
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谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β
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巯基乙醇的DMEM,且所述MX培养基为添加有38％KO
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DMEM、24％DMEM/F12、10％KOSR、L
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谷氨酰胺、非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和3.9mg/Lβ
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巯基乙醇、0.145g/L L
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谷氨酰胺、0.5％B27、0.25g/L牛血清白蛋白、和8μg/L碱性成纤维生长因子配制而成。9.根据权利要求1所述的方法，在步骤2中，所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪峰，赵树立，聂运中，窦德虎，阮海文，
申请(专利权)人：江苏鼎泰药物研究集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：