一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法，与动物实验相比，所构建的含有SLC转运体的细胞系模型细胞生命力强，培养方法简单，相对要比动物实验更经济高效；模型有较广泛的适用性，可用于原料药、制剂、大小分子的SLC转运体研究。大小分子的SLC转运体研究。

【技术实现步骤摘要】
一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法


[0001]本专利技术属于药学研究领域，本专利技术涉及一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法。

技术介绍

[0002]药物转运体是位于细胞膜上的功能性膜蛋白，按底物跨膜转运方向可分为参与药物吸收和外排的两大类转运体。介导药物进入细胞的转运体可将底物摄取至靶位以发挥药效，属于可溶性载体(solutecarrier,SLC)。SLC转运体在生物体内的药物吸收、分布、代谢及排泄等动力学过程中发挥着不可或缺的作用。转运体通过调节药物在细胞内外的浓度差，影响药物的吸收和分布，从而影响其药效和毒性。此外，SLC转运体还可以介导药物的代谢和排泄，从而影响药物的清除速率和体内停留时间。因此，是否为转运体的底物或抑制剂是引起药物相互作用、解毒药物治疗失败、药物耐受性产生以及某些疾病(如肝脏疾病、心血管疾病、神经系统疾病等)的重要原因。因此，对转运体的研究和了解有助于指导药物的合理使用、优化药物疗效、多药物联用、减少药物不良事件，进而为临床治疗和药物开发提供科学依据。
[0003]转染细胞研究转运体主要是通过将重组转运体基因稳定或瞬时转染于不同细胞系，用于研究转运体功能及药物相互作用。转染细胞系可单独表达吸收和外排转运体,或者二者共表达。用于构建转染细胞的细胞系众多，如MDCK、HEK239、LLC
‑
PK1和CHO细胞系等。构建过程包括将含目的基因片段的重组质粒转染至特定细胞，用G418进行筛选，挑选单克隆细胞后结合Western Blot、PCR、免疫荧光显微镜或放射性标记底物摄取/外排率等方法验证转染细胞是否构建成功。
[0004]UPLC
‑
MS/MS，全称为超高效液相色谱
‑
质谱联用技术(Ultra Performance Liquid Chromatography
‑
Mass Spectrometry)，是一种先进的分析技术。它将超高效液相色谱(UPLC)和质谱联用(MS)结合起来，在药物代谢动力学研究、生物样品分析、食品安全检测、环境监测等领域得到广泛应用。UPLC是一种比传统高效液相色谱(HPLC)更快、更高效的色谱分离技术，它使用的是小粒径的柱和较高的流速，使分离时的整体时间大大缩短，分离效果更好，分离峰更尖、更窄，分离能力更强。质谱联用则可以通过分析待测物的质量/电荷比来确定其分子结构和化学性质，具有高准确性、高灵敏度、高特异性和高选择性等优点，对于分析微量物质或者复杂混合物样品十分有效。
[0005]现有的转运体研究常用手段主要为Caco
‑
2细胞模型和原代细胞。Caco
‑
2细胞来源于人结肠癌细胞，与人小肠上皮细胞结构相似，MDR1、MRP2、PEPT1和OATP
‑
B等多种转运体在Caco
‑
2细胞中表达水平均较高。将药物与Caco
‑
2细胞培养一定时间后测定细胞内药物含量，可反映肠道对药物的吸收。Shan等采用Caco
‑
2细胞作为药物肠道吸收模型,研究P
‑
gp抑制剂粉防己碱(tetrandrine,Tet)对黄连素(berberine,BBR)的吸收促进作用。但是对Caco
‑
2细胞中的转运蛋白表达水平进行定量比较，发现Caco
‑
2细胞中部分转运体的表达水平显著低于人肠组织，因此当应用Caco
‑
2细胞研究以上转运体时应考虑这一因素。
[0006]原代细胞来源于完整组织，可表达存于该组织的全部转运体基因，与体内模型相关性较好，生化特性完整，可保留细胞内代谢酶。与亚细胞组分相比，保持了完整细胞的结构，更接近体内环境。可用于研究药物代谢、转运及临床药物的相互作用。然而原代细胞来源于完整分化组织，在培养一段时间后会丧失代谢及转运能力，由于失去体内其他组织结构，原代细胞不能完全替代整体动物转运体功能的评价。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法。
[0008]技术方案：本专利技术的判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法，包括以下步骤：
[0009](1)构建含有SLC转运体的细胞模型，所述SLC转运体分别包括OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2
‑
K，同时构建不含有SLC转运体的细胞模型；
[0010](2)将步骤(1)得到的细胞模型分别按下表加入与SLC转运体对应的阳性抑制剂或底物进行预孵育和孵育：
[0011]受试物SLC抑制剂试验：
[0012]组别预孵育时加入孵育时加入阳性对照组阳性抑制剂工作液底物工作液阴性对照组空白工作液底物工作液试验组受试物工作液底物工作液
[0013]受试物SLC底物试验：
[0014][0015][0016](3)孵育完成后去除液体，加入超纯水并反复冻融多次，得到裂解细胞样品；
[0017](4)配制各底物的标准曲线溶液；对各底物的标准曲线溶液及步骤(3)中得到的各裂解细胞样品分别进行样品前处理；
[0018](5)通过UPLC
‑
MS/MS检测各底物的标准曲线溶液获得各底物的标准曲线，检测经过样品前处理后的裂解细胞样品，获得加入受试物工作液和底物的峰面积比，将其带入对应的底物标准曲线即可得到底物和受试物浓度；通过酶标仪检测蛋白标准样品获得蛋白吸光度标准曲线；通过酶标仪BCA蛋白检测法检测加入受试物工作液的冻融后的裂解细胞样品吸光值，将其代入蛋白吸光度标准曲线即可得到加入受试物的裂解细胞样品的蛋白浓度，即M
amount
；
[0019](6)对步骤(5)检测的数据进行处理，计算出底物或受试物在含有SLC转运体的细胞模型中的摄取速率与不含有SLC转运体的细胞模型中的摄取速率的摄取率比率VR，及加
入受试物后底物在细胞模型中的摄取速率的下降率，即剩余酶活％RA；受试物SLC底物试验组中，当受试物的VR＞2，且加入阳性抑制剂后，底物在细胞模型中的摄取速率下降至少50％时，则受试物为SLC转运体底物；受试物SLC抑制剂试验组中，当底物在细胞模型中的摄取速率下降至少50％时，则受试物为SLC转运体抑制剂。
[0020]进一步地，空白工作液为HBSS缓冲液。
[0021]进一步地，受试物包括原料药、制剂、大小分子。
[0022]进一步地，步骤(1)中所述细胞包括HEK293、293T/17。
[0023]进一步地，步骤(2)中所述阳性抑制剂工作液及加入浓度为环孢素A0.01～50μM、丙磺舒0.1～100μM或西咪替丁0.1～2000μM；所述底物工作液及加入浓度为雌二醇葡糖苷酸E217βG 5～30μM、对氨基马尿酸PAH 20μM、雌酮硫酸E3S 5μM、MPP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种判断受试物是否为SLC转运体底物或抑制剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有SLC转运体的细胞模型，所述SLC转运体分别包括OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2
‑
K，同时构建不含有SLC转运体的细胞模型；(2)将步骤(1)得到的细胞模型分别按下表加入与SLC转运体对应的阳性抑制剂或底物进行预孵育和孵育：受试物SLC抑制剂试验：组别预孵育时加入孵育时加入阳性对照组阳性抑制剂工作液底物工作液阴性对照组空白工作液底物工作液试验组受试物工作液底物工作液受试物SLC底物试验：(3)孵育完成后去除液体，加入超纯水并反复冻融多次，得到裂解细胞样品；(4)配制各底物的标准曲线溶液；对各底物的标准曲线溶液及步骤(3)中得到的各裂解细胞样品分别进行样品前处理；(5)通过UPLC
‑
MS/MS检测各底物的标准曲线溶液获得各底物的标准曲线，检测经过样品前处理后的裂解细胞样品，获得加入受试物工作液和底物的峰面积比，将其带入对应的底物标准曲线即可得到底物和受试物浓度；通过酶标仪检测蛋白标准样品获得蛋白吸光度标准曲线；通过酶标仪BCA蛋白检测法检测加入受试物工作液的冻融后的裂解细胞样品吸光值，将其代入蛋白吸光度标准曲线即可得到加入受试物的裂解细胞样品的蛋白浓度，即M
amount
；(6)对步骤(5)检测的数据进行处理，计算出底物或受试物在含有SLC转运体的细胞模型中的摄取速率与不含有SLC转运体的细胞模型中的摄取速率的摄取率比率VR，及加入受试物后底物在细胞模型中的摄取速率的下降率，即剩余酶活％RA；受试物SLC底物试验组中，当受试物的VR＞2，且加入阳性抑制剂后，底物在细胞模型中的摄取速率下降至少50％时，则受试物为SLC转运体底物；受试物SLC抑制剂试验组中，当底物在细胞模型中的摄取速率下降至少50％时，则受试物为SLC转运体抑制剂。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述受试物包括原料药、制剂、大小分子。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述细胞包括HEK293、293T/17。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述阳性抑制剂工作液及加入浓度为环孢素A0.01～50μM、丙磺舒0.1～100μM或西咪替丁0.1～2000μM；所述底物工
作液及加入浓度为雌二醇葡糖苷酸E217βG 5～30μM、对氨基马尿酸PAH20μM、雌酮硫酸E3S 5μM、MPP
+
5μM或二甲双胍5μM；孵育摄取时间为10～40min。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述样品前处理包括：当底物/受试物类型为二甲双胍、雌酮3
‑
硫酸钠E3S和E217βG时：1)将裂解细胞样品在室温条件下以25...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊阿莉，何孟奇，程远国，胡惠影，聂加倍，陈开琰，
申请(专利权)人：江苏鼎泰药物研究集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：