【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物检测，具体而言涉及一种肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法。
技术介绍
1、cyp3a亚族是cyp450酶系中最主要的亚型之一，研究cyp3a4酶代谢对评价研究药物代谢特征及研究药物-药物之间相互作用起着重要的作用。cyp450代谢酶活性的改变，导致经代谢药物在体内的代谢速度增加或减慢，从而影响药物在机体内的血药浓度的改变，反映出药物作用效果的强弱的改变甚至是否产生毒性。因此，评价药物代谢过程中对cyp3a4代谢酶活性影响具有十分重要的意义。
2、目前研究的主要方向是提供体外方法研究药物代谢，研究代谢酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用，从而可有效缩短药物研发周期。
3、在cyp3a4代谢酶研究中，睾酮经cyp3a4代谢酶代谢后主要代谢产物为6β-羟基睾酮。在国内外相关文献睾酮作为cyp3a4代谢酶的特征性探针底物，通过测定其在肝微粒体中其主要代谢产物6β-羟基睾酮的含量变化，对cyp3a4代谢酶的活性进行评价。
4、在体外代谢抑制研究过程中，常用评价酶活性体外方法为探针药物法即cocktail鸡尾酒法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，建立药物代谢研究模型。但cocktail法采用同一个孵育体系，统一终止反应时间，不能很好地控制每个酶的反应程度，很容易出现反应过量的现象。
5、6β-羟基睾酮的检测分析方法目前报道的有高效液相色谱(hplc)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)，
6、现有技术文献：
7、中国专利：cn112649535a
8、中国专利：cn105181872a。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，该检测方法灵敏度高，稳定精确，且提高了分析效率。
2、为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，包括以下具体步骤：
4、s1、建立肝微粒体温孵体系
5、在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物进行预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中进行温孵；
6、s2、标准曲线样品及待测样品的配制
7、根据步骤s1中建立的肝微粒体温孵体系，将系列浓度的6β-羟基睾酮、混合的人肝微粒体、氯化镁溶液以及还原型辅酶ⅱ混合，配制系列浓度的标准曲线样品溶液；
8、按照步骤s1中的建立肝微粒体温孵体系，在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及100μm的睾酮底物进行预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中进行温孵，温孵结束后得到待测样品溶液；
9、s3、样品进样前处理
10、在步骤s2得到的标准曲线样品溶液和待测样品溶液中加入内标工作溶液终止反应，涡旋、振荡、离心，取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入超纯水溶液复溶，封膜、摇板；
11、s4、uplc-ms/ms分析检测
12、将步骤s3处理后的样品进行uplc-ms/ms分析检测，其中，
13、色谱检测条件：
14、流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；
15、洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；
16、色谱柱：acquity uplc hss t3；
17、流速：0.5ml/min；
18、保留时间：6β-羟基睾酮：1.29min；甲苯磺丁脲：1.46min；
19、洗脱时间：2.4min；
20、色谱洗脱程序为：0～0.3min流动相b的体积百分数为20％，0.3～1.2min流动相b的体积百分数为20％升至90％，1.2～1.8min流动相b的体积百分数为90％，1.8～1.9min流动相b的体积百分数为90％降至20％，1.9～2.5min流动相b的体积百分数为20％；
21、质谱条件为：
22、质谱离子源：esi电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：mrm多反应离子监测；碰撞气：medium；气帘气：40psi；分辨率q1/q3：unit/unit；喷雾气：55psi；辅助加热气：55psi；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；采集时长：2.40min；
23、根据检测结果得到6β-羟基睾酮的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的6β-羟基睾酮浓度。
24、优选地，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.2mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
25、优选地，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.200μm～40.0μm。
26、优选地，所述步骤s3中，内标工作溶液为5ng/ml的甲苯磺丁脲；上清液和超纯水的体积比为1:1；
27、前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心5min；以300rpm的转速摇板5min。
28、优选地，所述步骤s4中，色谱柱的规格为：长50mm×内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。
29、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中流速为0.5ml/min。
30、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样量为5μl。
31、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样时间为2.40min。
32、优选地，所述步骤s4中，离子监测采集参数如下：
33、6β-羟基睾酮：母离子为305.1da；子离子为227.0da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压61volts；碰撞电压为21volts；碰撞池入口电压为20volts；
34、甲苯磺丁脲：母离子为271.1da；子离子为91.1da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为21volts；碰撞电压为47volts；碰撞池入口电压为12volts。
35、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
36、1、本专利技术的uplc-ms/ms分析检测方法，在检测肝微粒体体系中6β-羟基睾本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.2mg/mL，氯化镁溶液的孵育浓度为10mM，还原型辅酶Ⅱ的孵育浓度为1mM；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
3.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，标准曲线样品浓度范围为0.200μM～40.0μM。
4.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，内标工作溶液为5ng/mL的甲苯磺丁脲；上清液和超纯水的体积比为1:1；
5.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，色谱柱的规格为：长50mm×内径2.1μm，填
6.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，UPLC检测条件中流速为0.5mL/min。
7.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，UPLC检测条件中进样量为5μL。
8.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，UPLC检测条件中进样时间为2.40min。
9.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，UPLC检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度为4℃。
10.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，离子监测采集参数如下：
...【技术特征摘要】
1.一种肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.2mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
3.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.200μm～40.0μm。
4.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s3中，内标工作溶液为5ng/ml的甲苯磺丁脲；上清液和超纯水的体积比为1:1；
5.根据权利要求1所述的肝微粒体体系中6β-羟基睾酮浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4...
【专利技术属性】
技术研发人员：何孟奇，胡惠影，樊阿莉，张雪峰，程远国，窦金辉，
申请(专利权)人：江苏鼎泰药物研究集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。